Production, characterization and in vivo functional analysis of intrabodies against the polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV

Das Neurale Zelladhäsionsmolekül (NCAM) ist ein primär auf Nervenzellen exprimiertes Adhäsionsmolekül und am Aufbau des Nervensystems sowie der Gehirnentwicklung beteiligt. Darüber hinaus reguliert es die Plastizität von Geweben im adulten Organismus. Durch die im Golgi-Apparat exprimierten Polysialyltransferasen ST8SiaII und ST8SiaIV kann das NCAM mit Polysialinsäure, einem Polymer der 5-N-Acetylneuraminsäure, modifiziert werden, was zu einer Umkehr der adhäsiven Eigenschaften und zu veränderten Interaktionsmöglichkeiten führt. Diese Funktion ist essentiell während der Embryogenese und wird bei einigen Tumorvarianten reaktiviert, wodurch deren Metastasierung gefördert wird. Intrabodies sind intrazellulär exprimierte, rekombinante Antikörperfragmente und ermöglichen den knockdown ihres Zielantigens, indem es gebunden und die Translokation in sein natürliches Zellkompartiment verhindert wird. ER-Intrabodies werden im Endoplasmatischen Retikulum exprimiert und verankert. In dieser Arbeit wurden aus im Vorfeld generierten monoklonalen Antikörpern gegen die Polysialyltransferasen ER-Intrabodies hergestellt, welche die Polysialylierung des NCAM durch Retention der Transferasen im ER verhindern sollten. Als Ausgangsmaterial wurde die RNA aus Hybridomazellen verwendet, woraus die Sequenzen der variablen Domänen gewonnen wurden. Anschließend wurden diese per PCR zu einer scFv-Sequenz kombiniert und nach Klonierung in den Vektor pCMV/myc/ER als ER-Intrabodies exprimiert. Die Bindung der Intrabodies an die Polysialyltransferasen wurde durch ELISA und Immunpräzipitation überprüft und ihre Retention im ER mittels Immunfluoreszenz gezeigt. Die verminderte Expression von polysialyliertem NCAM auf der Zelloberfläche konnte mit Hilfe der Durchflusszytometrie und im Immunblot demonstriert werden. Im Anschluss wurde die Funktionalität der Intrabodies in vivo getestet. Dazu wurden Zellen des Rhabdomyosarkoms stabil mit den Intrabodies sowie einer Luziferase transfiziert und in einem bereits etablierten Tumor-Mausmodell mittels IVIS hinsichtlich ihres Metastasierungspotentials untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die durch den Einsatz der Intrabodies reduzierte Expression von polysialyliertem NCAM die Metastasierung verzögern kann.The neural cell adhesion molecule (NCAM) is an adhesion molecule primarily expressed on cells of the nervous system. It is involved in organization of the nervous system as well as development of the brain. Furthermore, it regulates tissue plasticity in the adult organism. The polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV are expressed in the golgi apparatus and are able to uniquely modify the NCAM with polysialic acid, a polymer of the 5-N-Acetylneuraminic acid. This leads to the reversal of its adhesive properties and to altered possibilities of interaction. This function is essential during embryogenesis and is reactivated in certain variants of tumors in order to facilitate metastasis. Intrabodies are recombinant antibody fragments which are expressed intracellularly, allowing the knockdown of their target antigen through binding and thus avoiding its translocation in its natural cell compartment. ER Intrabodies are expressed and retained in the endoplasmic reticulum. In this study, ER intrabodies were assembled from previously generated monoclonal antibodies against the polysialyltransferases which should avoid the polysialylation of NCAM through ER retention of the transferases. As primary material RNA from hybridoma cells was used to obtain the sequences of the variable domains. Using PCR, they were combined to a scFv sequence and expressed as ER intrabody after cloning into pCMV/myc/ER vector. The binding between intrabodies and polysialyltransferases was veryfied by ELISA as well as immunoprecipitation and ER retention was shown by immunofluorescence. The resulting reduced expression of polysialylated NCAM on the cell surface was demonstrated by flow cytometry and immunoblotting. Afterwards the functionality of the intrabodies was tested in vivo. For this purpose, cells of the rhabdomyosarcoma were stably transfected with the intrabodies together with a luciferase and were applied in an established mouse tumor model to study their metastatic potential using IVIS. Thereby it has been shown that the reduced expression of polysialylated NCAM caused by applying the intrabodies is capable of delaying metastasis

Intrabodies against the Polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV inhibit Polysialylation of NCAM in rhabdomyosarcoma tumor cells.

Polysialic acid (polySia) is a carbohydrate modification of the neural cell adhesion molecule (NCAM), which is implicated in neural differentiation and plays an important role in tumor development and metastasis. Polysialylation of NCAM is mediated by two Golgi-resident polysialyltransferases (polyST) ST8SiaII and ST8SiaIV. Intracellular antibodies (intrabodies; IB) expressed inside the ER and retaining proteins passing the ER such as cell surface receptors or secretory proteins provide an efficient means of protein knockdown. To inhibit the function of ST8SiaII and ST8SiaIV specific ER IBs were generated starting from two corresponding hybridoma clones. Both IBs αST8SiaII-IB and αST8SiaIV-IB were constructed in the scFv format and their functions characterized in vitro and in vivo

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Luminescence picture after injection of tumor cells expressing anti-ST8SiaII-IB and anti-ST8SiaIV-IB in mice (week 4). Luminescence was determined at week 4 using in vivo imaging system. On the ride side are seen the luminescence signals (p/Sec/cm2/sr). (TIF 286 kb