Conductometric Biosensor Based on Urease, Adsorbed on Silicalite for Determination of Urea in Serum Samples

The method of enzyme adsorption on nano- and microsized zeolites, developed by us, is described. It is notable by such advantages as simple and fast performance, the absence of toxic compounds, high reproducibility and repeatability. The biosensor based on the method developed was applied for urea measurement in samples of blood serum. It was shown that the biosensor could surely distinguish healthy people from people with renal dysfunction. Good results reproducibility was proved at urea determination in real samples of blood serum (RSD = 10%). For these reasons, the biosensors based on enzyme adsorption are more suitable for standardization and production than those based on conventional methods of immobilization. When you are citing the document, use the following link http://essuir.sumdu.edu.ua/handle/123456789/3547

Development of amperometric biosensor for choline determination

Aim. Development of an amperometric biosensor for measuring choline concentration in water samples. Methods. A bioselective element of the biosensor was created using choline oxidase which was covalently immobilized by glutaraldehyde crosslinking with bovine serum albumin on the surface of an amperometric platinum disk electrode. Results. The conditions of the bioselective element formation (the enzyme and glutaraldehyde concentrations, time of procedure) were optimized. The biosensor developed was characterized by good response reproducibility over hours of continuous operation. The linear range of substrate determination ranged from 10 µM to 1000 µM, a limit of choline detection – 1–3 µM, the biosensor sensitivity was 25–30 nA/mM. An effect of interfering substances was significantly reduced by the application of an additional semipermeable poly-m-phenylenediamine (PPD) membrane. Conclusions. The developed biosensor is well-suited for choline determination in water samples.Мета. Розробка амперометричного біосенсора для визначення концентрацій холіну у водних зразках. Методи. Для створення біоселективного елементу біосенсора використовували холін оксидазу, що була іммобілізована ковалентною зшивкою глутаровим альдегідом з бичачим сироватковим альбуміном на поверхню амперометричного дискового платинового електроду. Результати. Було проведено оптимізацію умов формування біоселективного елементу на поверхню перетворювача (концентрація ферменту і глутарового альдегіду та час іммобілізації). Біосенсор характеризується доброю відтворюваністю відгуків впродовж декількох годин безперервної роботи. Лінійний діапазон визначення субстрату знаходився в межах від 10 мкМ до 1000 мкМ, мінімальна межа визначення холіну – 1–3 мкМ, чутливість біосенсора 25–30 нА/мМ. Завдяки використанню додаткової напівпроникної мембрани з полі-m-фенілендіаміну (ПФД) було значно зменшено вплив інтерферентів на роботу біосенсора. Висновки. Показано, що розроблений біосенсор добре підходить для визначення холіну у водних зразках.Цель. Разработка амперометрического биосенсора для определения концентраций холина в водных образцах. Методы. Для создания биоселективного элемента использовали холин оксидазу, иммобилизованную ковалентной сшивкой глутаровым альдегидом с бычьим сывороточным альбумином на поверхность амперометрического дискового платинового электрода. Результаты. Была проведена оптимизация условий формирования биоселективного елемента на поверхность преобразователя (концентрация фермента и глутарового альдегида та время иммобилизации). Биосенсор характеризируется хорошей воспроизводимостью откликов на протяжении нескольких часов непрерывной работы. Линейный диапазон определения субстрата находился в пределах от 10 мкМ до 1000 мкМ, минимальная граница определения холина – 1–3 мкМ, чувствительность биосенсора 25–30 нА/мМ. Благодаря использованию дополнительной полупроницаемой мембраны с поли-м-фенилендиамина (ПФД) было значительно уменьшено влияние интерферентов на работу биосенсора. Выводы. Показано, что разработанный биосенсор хорошо применим для определения холина в водных образцах

Conductometric urease microbiosensor based on thin-film interdigitated electrodes for urea determination

The characteristics of conductometric urease microbiosensor based on thin-film interdigitated electrodes for urea determination have been studied. Urease has been immobilized by cross-linking with bovine serum albumin using glutaraldehyde. The resulting conductivity changes are produced by enzymatically catalyzed hydrolysis of urea. This process for both immobilized enzyme and soluble one is described by the classic laws of enzymatic kinetics. The influence of ionic strength, pH and buffer capacity of the samples on the biosensor response has been thoroughly tested. The results have been discussed concerning urea concentration analysis in human blood

Inhibition of immobilized acetylcholinesterase by aflatoxin B1 in a potentiometric biosensor

Aim. To identify a type of inhibition of immobilized acetylcholinesterase by aflatoxin B1. Methods. A bioselective element of the potentiometric biosensor was created using acetylcholinesterase, which was covalently immobilized on the surface of the pH-FET sensor by glutaraldehyde crosslinking with bovine serum albumin. Results. Optimal conditions for the potentiometric biosensor operation such as pH-optimum of the enzyme action and its inhibition were defined. An apparent Michaelis constant, as well as a maximum initial reaction rate of immobilized acetylcholinesterase as a part of the biosensor were determined. The type of reversible inhibition of immobilized acetylcholinesterase by aflatoxin B1 in potentiometric biosensor was identified by using a new graphical “degree of inhibition” method and the obtained result was confirmed with one of the tradi-tional methods, such as the Lineweaver-Burk plot. Conclusions. This study helps to understand the mechanisms of enzyme inhibition in biosensors and brings the biosensor implementation closer.Мета. Визначення типу інгібування іммобілізованої ацетилхолінестерази афлатоксином B1. Методи. Біоселективний елемент потенціометрического біосенсора був створений використовуючи поперечну зшивку ацетилхолінестерази з бичачим сироватковим альбуміном в мембрані за допомогою глутарового альдегіду. Результати. Визначено оптимальні умови роботи потенціометричного біосенсора, такі як рН-оптимум роботи ферменту та його інгібування. Були визначені уявна константа Міхаеліса, а також максимальна початкова швидкість ферментативної реакції іммобілізованої ацетилхолінестерази в складі біосенсора. Тип оборотного інгібування іммобілізованої ацетилхолінестерази афлатоксином В1 в складі потенціометричного біосенсора був ідентифікований з використанням нового графічного методу – методу «ступеня інгібування», отриманий результат був підтверджений за допомогою одного із традиційних методів –Лайнуівера-Берка. Висновки. Це дослідження допомагає зрозуміти механізми інгібування ферменту в складі біосенсора та наближує впровадження біосенсора у виробництво.Цель. Определение типа ингибирования иммобилизованной ацетилхолинэстеразы афлатоксином B1. Методы. Биоселективный элемент потенциометрического биосенсора был создан, используя поперечную сшивку ацетилхолинэстеразы с бычьим сывороточным альбумином в мембране при помощи глутарового альдегида. Результаты. Определены оптимальные условия работы потенциометрического биосенсора, такие как рН-оптимум работы фермента и его ингибирования. Были определены кажущаяся константа Михаэлиса, а также максимальная начальная скорость ферментативной реакции иммобилизованной ацетилхолинэстеразы в составе биосенсора. Тип обратимого ингибирования иммобилизованной ацетилхолинестеразы афлатоксином В1 в составе потенциометрического биосенсора был установлен при помощи нового графического метода – метода «степени ингибирования», полученный результат был подтвержден с помощью одного из традиционных методов – Лайнуивера-Берка. Выводы. Это исследование помогает понять механизмы ингибирования фермента в составе биосенсора и приближает внедрение биосенсора в производство

Potato glycoalkaloids detection based on conductometric sensor coupled to butyryl cholinesterase

For the construction of a biosensor sensitive to some steroidal glycoalkaloids a conductometric planar electrode as a transducer and the horse serum butyryl cholinesterase (BuChE) as a biorecognition element have been used. It has been shown that α-solanine, α-chaconine and solanidine can be detected within the range of their concentrations from 0.2 to 100 mM depending on the type of steroidal alkaloid used. The detection limits were estimated to be 0.2 mM for chaconine and 0.5 mM for solanine/solanidine. The responses of the sensors developed were reproducible: the relative standard deviation was about 1.5 % and 5 % for intra- and inter-sensor responses, respectively. Moreover, one sensor with the immobilized enzyme can be used repeatedly (for at least 100 measurements) after a simple washing by buffer and can be stored at room temperature without substantial loss in activity of the immobilized enzyme not less than 1 month. It has been shown that all the analytes investigated inhibit reversibly and competitively the horse BuChE immobilized on the transducer surface. In assays, which combined α-solanine and α-chaconine, inhibition of BuChE was not additive. A possibility to apply the biosensor developed for the quantitative detection of the total steroidal alkaloids pool in foodstuffs and some biological samples is discussed.При створенні біосенсора, чутливого до стероїдних гліко­алкалоїдів, застосовано кондуктометричний планарний елект­род як перетворювач і бутирилхолінестеразу (БуХЕ) як чут­ливий елемент. Соланін, чаконін та соланідин визначали в діапазоні концентрацій 0,2—100 мкМ залежно від типу алка­лоїду. Мінімальні концентрації, які визначаються за допомо­гою біосенсора, становлять 0,2 мкМ для чаконіну та 0,5 мкМ для соланіну/соланідину. Відносні стандартні внутрішньо- та міжсенсорні похибки складали 1,5 та 5 % відповідно. Крім того, той самий сенсор з іммобілізованим ферментом після відмивання в буфері можна багаторазово використовувати (щонайменше 100 вимірів) та зберігати за кімнатної темпе­ратури без суттєвого зменшення активності іммобілізо­ваного ферменту протягом місяця. Доведено, що всі дослід­жені речовини конкурентно та оборотно пригнічують кінську БуХЕ, іммобілізовану на поверхні перетворювача. При до­слідженні спільної дії α-соланіну та α-чаконіну додаткового пригнічення БуХЕ не спостерігалося. Обговорюється мож­ливість застосування розробленого біосенсора для кількісного визначення загальної фракції стероїдних глікоалкалоїдів у хар­чових продуктах та деяких біологічних зразках.Для создания биосенсора, чувствительного к стероидным гликоалкалоидам, использовали кондуктометрический планарный электрод в качестве преобразователя и бутирилхолинэстеразу (БуХЭ) как чувствительный элемент. Соланин, чаконин и соланидин определяли в диапазоне концентраций 0,2–100 мкМ в зависимости от типа алкалоида. Минимально определяемая концентрация для чаконина – 0,2 мкМ, для соланина/соланидина – 0,5 мкМ. Относительные стандартные внутри- и межсенсорные ошибки составили 1,5 и 5 % соответственно. Кроме того, один и тот же сенсор с иммобилизованным ферментом после простого отмывания буфером можно мно­горазово использовать (по меньшей мере, 100 измерений) и хранить при комнатной температуре без значительной поте­ри активности иммобилизованного фермента в течение меся­ца. Показано, что исследуемые вещества конкурентно и обра­тимо ингибируют лошадиную БуХС, иммобилизованную на поверхности преобразователя. При исследовании совместного действия α-соланина и α-чаконина дополнительного ингибирования БуХЭ не наблюдалось. Обсуждается возможность при­менения разработанного биосенсора для количественного опре­деления общей фракции стероидных гликоалкалоидов в пищевых продуктах и некоторых биологических образцах

Amperometric biosensor for lactate analysis in wine and must during fermentation

MADICA 2006 Conference, Fifth Maghreb-Europe Meeting on Materials and their Applicatons for Devices and Physical, Chemical and Biological Sensors, MADICA 2006 Conference, Fifth Maghreb-Europe Meeting on Materials and their Applicatons for Devices and Physical, Chemical and Biological SensorsInternational audienceA lactate oxidase-based amperometric biosensor is designed for lactate determination. Two methods of lactate oxidase immobilization on the surface of commercial SensLab platinum printing electrodes are compared. The sensor with lactate oxidase immobilized by physical adsorption in Resydrol polymer is shown to have both narrower dynamic range (0.004–0.5 mМ lactate) and higher sensitivity (320 nA/mM) as compared with that immobilized in poly(3,4-ethylenedioxythiophene) by electrochemical polymerization (0.05–1.6 mM and 60 nA/mM respectively). The operational stability of the biosensors developed is studied; the immobilization method is shown to be of no influence. The lactate content in wine and in wine material during fermentation is analyzed. The data obtained by amperometric lactate biosensor correlated with those of standard chromatography. The biosensor developed can be used in food industry for control and optimization of process of wine fermentation as well as for control of wine quality

Elaboration of new method of enzyme adsorption on silicalite and nano beta zeolite for amperometric biosensor creation

Aim. Optimization of a new method of enzyme immobilization for amperometric biosensor creation. Methods. The amperometric biosensor with glucose oxidase immobilized on zeolites as bioselective elements and platinum disk electrode as transducers of biochemical signal into the electric one was used in the work. Results. The biosensors based on glucose oxidase adsorbed on zeolites were characterized by a higher sensitivity to glucose and a better inter-reproducibility. The best analytical characteristics were obtained for the biosensors based on nano beta zeolite. It has been found that an increase in the amount of zeolite on the surface of amperometric transducer may change such biosensor parameters as sensitivity to the substrate and duration of the analysis. Conclusions. The proposed method of enzyme immobilization by adsorption on zeolites is shown to be quite promising in the development of amperometric biosensors and therefore should be further investigated.Мета. Оптимізація нового методу іммобілізації ферментів для розробки амперометричних біосенсорів. Методи. Використано іммобілізовану глюкозооксидазу на цеоліті як біоселективний елемент біосенсора та платиновий дисковий електрод – як амперометричний перетворювач біохімічного сигналу в електричний. Результати. Біосенсор на основі глюкозооксидази, адсорбованої на цеолітах, вирізняється високою чутливістю до глюкози та покращеною інтер-відновлюваністю виготовлення біосенсорів. Найкращі аналітичні характеристики притаманні біосенсору на основі нано-бета цеоліту. Встановлено, що при зміні кількості цеолітів на поверхні амперметричного перетворювача можна варіювати параметри біосенсора, такі як чутливість до субстрату та час аналізу. Висновки. Показано, що запропонований метод іммобілізації, а саме – адсорбція ферментів на цеолітах є дуже перспективним при розробці амперометричних біосенсорів.Цель. Оптимизация нового метода иммобилизации ферментов для разработки амперометрических биосенсоров. Методы. Использовали иммобилизованную глюкозооксидазу на цеолитах как биоселективный элемент биосенсора и платиновый дисковый электрод – как амперометрический преобразователь биохимического сигнала в электрический. Результаты. Биосенсор на основе глюкозооксидазы, адсорбированной на цеолитах, отличается высокой чувствительностью к глюкозе и улучшенной интер-воспроизводимостью приготовления биосенсоров. Наилучшими аналитическими характеристиками обладает биосенсор на основе нано-бета цеолита. Установлено, что при изменении количества цеолитов на поверхности амперометрического преобразователя можно менять параметры биосенсора, такие как чувствительность к субстрату и время анализа. Выводы. Показано, что предложенный метод иммобилизации, а именно – адсорбция ферментов на цеолитах является перспективным при разработке амперометрических биосенсоров

Conductometric urease microbiosensor based on thin-film interdigitated electrodes for urea determination

The characteristics of conductometric urease microbiosensor based on thin-film inter-digitated electrodes for urea determination have been studied. Urease has been immobilized by cross-linking with bovine serumalbumin using glutaraldehyde. The resulting conductivity changes are produced by enzymatically catalyzed hydrolysis of urea. This process for both immobilized enzyme and soluble one is described by the classic laws of enzymatic kinetics. The influence of ionic strength, pH and buffer capacity of the samples on the biosensor response has been thoroughly tested. The results have been discussed concerning urea concentration analysis in human blood.Вивчено характеристики кондуктометричного уреазного біосенсора для визначення сечовини на основі тонкоплівкових гребінчастих електродів. Уреазу іммобілізовали ковалентною зшивкою з сироватковим альбуміном бика за допомогою глутарового альдегіду. Результуючі зміни провідності викликано ферментативним гідролізом сечовини. Згаданий процес як для іммобілізова­ ного, так і для вільного ферменту описується класичними законами ферментативної кінетики. Досліджено вплив на величину відгуку іонної сили, рН та буферної ємності розчину. Розглянуто питання стосовно визначення концентрації сечовини у крові людини.Изучены характеристики кондуктометрического уреазного микробиосенсора для определения мочевины на основе тонкопленочных гребенчатых электродов. Уреазу иммобилизовали ковалентной сшивкой с бычьим сывороточным альбумином с помощью глутарового альдегида. Результи­рующее изменение проводимости вызвано ферментативным гидролизом мочевины. Этот про­цесс как для иммобилизованного, так и для свободного фермента описывается классическими законами ферментативной кинетики. Исследовано влияние на величину отклика ионной силы, рН и буферной емкости раствора Рассмотрены вопросы, связанные с определением концентра­ ции мочевины в крови человека

Highly selective amperometric biosensor for uric acid determination in real samples

Aim. To develop an amperometric biosensor based on immobilized uricase (1.7.3.3) from Arthrobacter Globiformis and a platinum disk electrode for the detection of uric acid in biological fluids. Methods. To obtain a highly selective detection of the uric acid concentration, an additive semi-permeable polymer film was formed on the surface of a platinum disk electrode by electro-polymerisation of m-phenylene diamine. The enzymatic selective layer was formed on the poly-m-phenylene diamine membrane using uricase immobilized in BSA matrix by a non-toxic crosslinking agent – poly(ethylene glycol) diglycidyl ether (PEGDE). Results. An influence of possible interfering substances – ascorbic acid, cysteine, urea, glucose, glutamic acid and lactic acid – was studied. Almost no effect of these electrochemical compounds on the biosensor response was found, indicating that the selectivity of the developed biosensor is very high. The biosensor characteristics were determined: detection limit 0.001 mM (s/n = 3), linear working range 0.008–0.218 mM, sensitivity 165 μA·mM⁻¹ cm⁻². The biosensor stability and reproducibility were studied and shown. Conclusions. The developed biosensor was validated by comparing the results of the urine samples analysis provided with the biosensor and the spectrophotometric method (correlation coefficient r = 0.99).This biosensor is found to be promising method for uric acid detection in the real samples.Мета. Розробити амперометричний біосенсор на основі іммобілізованої урікази (1.7.3.3) з Arthrobacter Globiformis і платинового дискового електрода для визначення сечової кислоти в біологічних рідинах. Методи. Для досягнення високоселективного визначення концентрації сечової кислоти на поверхні платинового дискового електрода сфо-рмована додаткова напівпроникна мембрана шляхом електрополімерізаціі м-фенілендіаміна. Ферментний селективний шар сформований на полі-м-фенілендіаміновій мембрані з використанням урікази, що іммобілізована в матриці БСА, в якості зшиваючого агента використовували нетоксичний поліетиленгліколь дигліцидиловий естер (ПЕГДЕ). Результати. Досліджено вплив інтерферуючих речовин: аскорбінової кислоти, цистеїну, сечовини, глюкози, глутамінової кислоти, молочної кислоти на активність розробленого біосенсору і показана відсутність впливу цих електрохімічно активних речовин на відгук біосенсора, що свідчить про дуже високу селективність розробленого біосенсора. Визначені наступні характеристики біосенсора: мінімальна концентрація, що визначалась 0.001 мM (s/n = 3), робочий лінійний діапазон 0.008–0.218 мM, чутливість 165 мкА∙мМ⁻¹ см⁻². Також досліджені і пока-зані операційна стабільність біосенсора і його стабільність при зберіганні. Висновки. Апробація розробленого біо-сенсора при аналізі реальних зразків сечі показала хорошу кореляцію даних із класичним спектрофотометричним методом (коефіцієнт кореляції r = 0.99). Таким чином, даний біосенсор є перспективним методом і може бути застосований в медичній діагностиці для визначення сечової кислоти в реальних зразках.Цель. Разработать амперометрический биосенсор на основе иммобилизированной уриказы (1.7.3.3) из Arthrobacter Globiformis и платинового дискового электрода для определения мочевой кислоты в биологических жидкостях. Методы. Для достижения высокоселективного определения концентрации мочевой кислоты на поверхности платинового дискового электрода была сформирована дополнительная полупроницаемая мембрана путём электрополимеризации м-фенилендиамина. Ферментный селективный слой сформирован на поли-м-фенилендиаминовой мембране с использованием уриказы, иммобилизированной в матрице БСА, в качестве сшивающего агента использовали нетоксичный диглицидиловый эфир полиэтиленгликоля (ПЭГДЭ). Результаты. Исследовано влияние интерферирующих веществ: аскорбиновой кислоты, цистеина, мочевины, глюкозы, глутаминовой кислоты, мо-лочной кислоты на активность разработанного биосенсора и показано отсутствие влияния этих электрохимически активных веществ на отклик биосенсора, что свидетельствует об очень высокой селективности разработанного биосенсора. Определены следующие характеристики биосенсора: граничная определяемая концентрация 0.001 мM (s/n = 3), рабочий линейный диапазон 0.008–0.218 мM, чувствительность 165 мкА•мМ⁻¹ см⁻². Также исследованы и продемонстрированы операционная стабильность биосенсора и его стабильность при хранении. Выводы. Апробация разработанного биосенсора при анализе реальных образцов мочи показала хорошую корреляцию данных с классическим спектрофотометрическим методом (коэффициент корреляции r = 0.99). Таким образом, данный биосенсор является перспективным методом и может быть использован в медицинской диагностике для определения мочевой кислоты в реальных образцах

Study on interactions of human IgG with immobilized anti-IgG or recombinant Staphylococcal protein A using surface plasmon resonance spectrometry

Aim. Comparison of the IgG-binding activity of recombinant Staphylococcal protein A with introduced C-terminal cysteine residue (SPA-Cys) or goat anti-human IgG antibodies (anti-IgG) after their immobilization on a gold sensor surface of surface plasmon resonance (SPR) spectrometer. Methods. SPA-Cys or anti-IgG were immobilized on a gold sensor surface to form two variants of a bioselective element of the immunosensor. SPR spectrometry was used for the detection of IgG-binding activity of the immobilized proteins. Results.The SPR sensor response to the immobilization of anti-IgG was more than two times higher than that at the immobilization of SPA-Cys. However, there is almost the double advantage for SPA-Cys in the number of immobilized molecules. Moreover, the bioselective element of the immunosensor based on SPA-Cys showed a much better capability of binding Ig than bioselective element based on anti-IgG. Conclusions.The study on the immobilization of SPA-Cys or anti-IgG on the sensor surface of SPR spectrometer, and the interactions of immobilized proteins with human IgG demonstrated obvious advantages of SPA-Cys.Мета. Порівняння імуноглобулін-зв’язувальної активності козячих антитіл проти IgG людини (анти-IgG) або рекомбінантного білка A Staphylococcus aureus зі спеціально введеним С-кінцевим залишком цистеїну (SPA-Cys) після їх іммобілізації на золотій сенсорній поверхні спектрометра поверхневого плазмонного резонансу (ППР). Методи. SPA-Cys або анти-IgG були іммобілізовані на золотій сенсорній поверхні для формування двох варіантів біоселективного елементу імуносенсора. Дослідження IgG-зв’язувальної активності іммобілізованих білків проводили за допомогою спектрометрії ППР. Результати. Сенсорний відгук при іммобілізації анти-IgG виявився більш ніж удвічі вищим за відгук, отриманий при іммобілізації SPA-Cys. Однак по кількості іммобілізованих молекул – майже двократна перевага за SPA-Cys. Крім того, біоселективний елемент імуносенсора на основі SPA-Cys значно краще зв’язує IgG, ніж біоселективний елемент на основі анти-IgG. Висновки. Дослідження процесів іммобілізації SPA-Cys або анти-IgG на сенсорній поверхні спектрометра ППР, а також взаємодії іммобілізованих білків з IgG продемонструвало очевидні переваги рекомбінантного білка А.Цель. Сравнение иммуноглобулин-связующей активности козьих антител против IgG человека (анти-IgG) или рекомбинантного белка A Staphylococcus aureus со специально введенным С-концевым остатком цистеина (SPA-Cys) после их иммобилизации на золотой сенсорной поверхности спектрометра поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Методы. SPA-Cys или анти-IgG были иммобилизованы на золотой сенсорной поверхности для формирования двух вариантов биоселективного элемента иммуносенсора. Исследование IgG-связующей активности иммобилизованных белков проводили с помощью спектрометрии ППР. Результаты. Сенсорный отклик при иммобилизации анти-IgG оказался более чем вдвое выше отклика, полученного при иммобилизации SPA-Cys. Однако по количеству иммобилизованных молекул – почти двукратное преимущество за SPA-Cys. Кроме того, биоселективный элемент иммуносенсора на основе SPA-Cys значительно лучше связывает IgG, чем биоселективный элемент на основе анти-IgG. Выводы. Исследование процессов иммобилизации SPA-Cys или анти-IgG на сенсорной поверхности спектрометра ППР, а также взаимодействия иммобилизованных белков с IgG продемонстрировало очевидные преимущества рекомбинантного белка А