Pharmacological study of the antineoplastic activity of new triazolo-[3,4-b]-1,3,4-thiadiazole derivatives

The fusion of 1,2,4-triazole and 1,3,4-thiadiazole rings generated a category of therapeutic agents with a broad spectrum of pharmacological properties including anticancer. The significant chemical potentialities of 1,2,4-triazoles and 1,3,4-thiadiazoles led to the design and synthesis of new 3,6-disubstituted 1,2,4-triazolo-[3,4-b]-1,3,4-thiadiazoles derivatives some of which stood out for their in vitro and in vivo anticancer activity. The present study aims to the in vitro evaluation of the pharmacological anticancer activity of novel compounds and screening of the most effective, investigation of protein targets and finally in vitro estimation of their impact on the predictive biomarkers, MSI (microsatellite instability), PD-L1 (programmed death ligand-1) and TMB (tumor mutation burden). Additionally, the apoptotic activity and the effect on cell cycle progression induced by the most effective compound were studied. For the purpose of this study, human cancer cell lines were used: five colorectal (DLD-1, HT-29, LoVo, LS174T, SW403) and two prostate (DU-145, PC-3) with different MSI phenotypes. The in vitro antineoplastic activity of KA25, KA26, KA39, SF29, and SF30 was assessed according to MTT assay, while the effect of KA39 on apoptosis and cell cycle was determined by staining assays such as annexin V/7-AAD and propidium iodide, respectively. In the context of the antineoplastic activity of the tested compounds, in silico studies were carried out according to which TopIIα and Akt1/2 proteins constitute potential therapeutic targets. In case of TopIIα, the inhibitory effect of KA25, KA26, and KA39 was investigated both on its catalytic activity (plasmid-based topoisomerase II drug screening kit) and its phosphorylation (Human Phospho-TOP2A/Topoisomerase II Alpha Cell-Based Phosphorylation ELISA Kit). As far as it concerns Akt1/2 kinases, KA25 and KA39 were estimated as potential inhibitors by intracellular flow cytometry. The impact of the most effective derivative, KA39, on the immunogenic predictive biomarkers, PD-L1, MSI και TMB, was studied in MSI-H and MSS cancer cells according to extracellular flow cytometry, PCR analysis conducted in the five microsatellite systems of Bethesda panel and targeted sequencing (Oncomine™ Tumor Mutation Load Assay), respectively. According to MTT results, among all the tested triazolo-[3,4-b]-thiadiazoles derivatives, KA39 emerged as the most effective due to its significant cytostatic and cytotoxic activity induced in all cancer cell lines (P<0.001). The administration of KA39 in cancer cells induced early and late apoptosis, as well as caused cell cycle arrest at phase S (P<0.001). The KA39-induced formation of supercoiled DNA during the relaxation reaction of plasmid DNA in combination with the statistically significant reduction of TopIIα phosphorylation indicates that KA39 belongs to TopIIα inhibitors. Furthermore, a remarkable inhibition of Akt1/2 phosporylation was impelled upon treatment with KA25 and KA39 (P<0.01). Moreover, the effect of KA39 triggered the overexpression of the immunoregulatory molecule, PD-L1, in MSI-H and MSS cancer cells. Additionally, the MMR mechanism was destabilized, particularly in MSI-H and to a lesser extent in MSS cancer cell lines. Finally, comparing control groups with the cells that received KA39, no alterations were observed in TMB.To conclude, among the new triazolo-[3,4-b]-thiadiazoles derivatives, the chemical compound KA39 was proved as the most effective, according to the in vitro cytostatic and cytotoxic activity induced in all the tested cancer cell lines. The current findings imply that KA39 behaves as a multitarget drug, inducing a remarkable antineoplastic activity as well as triggering the expression of the PD-L1 ligand and provoking simultaneously disorders in the functionality of the MMR mechanism, which are reflected in MSI phenotype. Conclusively, KA39 derivative seems to be a very promising anticancer agent with possibilities for further development in clinical practice and cancer chemo-immunotherapy.Η σύντηξη του 1,2,4-τριαζολικού δακτυλίου με τον 1,3,4-θειαδιαζολικό δακτύλιο αποτελεί μια κατηγορία θεραπευτικών παραγόντων με ευρύ φάσμα φαρμακολογικών ιδιοτήτων συμπεριλαμβανομένου της αντικαρκινικής. Οι σημαντικές δυνατότητες χημικής σύνθεσης των 1,2,4-τριαζολίων και 1,3,4-θειαδιαζολίων οδήγησαν στο σχεδιασμό και σύνθεση νέων παραγώγων 3,6 διϋποκατεστημένων 1,2,4-τριαζολο-[3,4-b]-1,3,4-θειαδιαζολίων εκ των οποίων κάποια ξεχώρισαν για την in vitro και in vivo αντικαρκινική τους δράση.Σκοπός είναι η in vitro εκτίμηση της φαρμακολογικής αντικαρκινικής δράσης νέων πρωτότυπων ενώσεων και η διαλογή των αποτελεσματικότερων εξ’ αυτών, η διερεύνηση των πρωτεϊνών που αποτελούν στόχους των υπό μελέτη παραγώγων και τέλος η in vitro αξιολόγηση των επιδράσεών τους στους προβλεπτικούς βιοδείκτες MSI (microsatellite instability), PD-L1 (programmed death ligand-1) και TMB (tumor mutation burden). Επίσης, μελετήθηκε η αποπτωτική δράση και η επίδραση των υπό μελέτη μορίων στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.Για τις ανάγκες της εργασίας, χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές: πέντε παχέος εντέρου (DLD-1, HT-29, LoVo, LS174T, SW403) και δύο προστάτη (DU-145, PC-3) με διαφορετικούς MSI φαινοτύπους. Η in vitro αντινεοπλασματική δράση των παραγώγων ΚΑ25, ΚΑ26, ΚΑ39, SF29 και SF30 μελετήθηκε με τη μέθοδο MTT ενώ με τις μεθόδους χρώσης με αννεξίνη V/7-AAD και ιωδιούχο προπίδιο εκτιμήθηκε η επίδραση του μορίου ΚΑ39 στην απόπτωση και στον κυτταρικό κύκλο, αντίστοιχα. Σχετικά με την αντινεοπλασματική δράση των υπό μελέτη μορίων, διεξήχθησαν in silico υπολογιστικές μελέτες οι οποίες ανέδειξαν τις πρωτεΐνες TopIIα και Akt1/2 ως πιθανούς στόχους. Στην περίπτωση της TopIIα, η ανασταλτική επίδραση των παραγώγων ΚΑ25, ΚΑ26 και ΚΑ39 διερευνήθηκε τόσο στην καταλυτική της δραστηριότητα (plasmid-based topoisomerase II drug screening kit) όσο και στη φωσφορυλίωσή της (Human Phospho-TOP2A/Topoisomerase II Alpha Cell-Based Phosphorylation ELISA Kit). Σχετικά με τις κινάσες Akt1/2, εξετάσθηκαν τα παράγωγα ΚΑ25 και ΚΑ39 ως πιθανοί αναστολείς με τη μέθοδο της ενδοκυττάριας κυτταρομετρίας ροής. Η επίδραση του πλέον δραστικού παραγώγου ΚΑ39 στους ανοσογόνους προβλεπτικούς δείκτες, PD-L1, MSI και TMB, μελετήθηκε σε MSI-H και MSS καρκινικά κύτταρα με τη μέθοδο της εξωκυττάριας κυτταρομετρίας ροής, με PCR ανάλυση για τα πέντε συστήματα μικροδορυφόρων του πάνελ Bethesda και της στοχευμένης αλληλούχισης (Oncomine™ Tumor Mutation Load Assay), αντίστοιχα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των MTT πειραμάτων, από τα υπό μελέτη παράγωγα των τριαζολο-[3,4-b]-θειαδιαζολίων, ως πιο δραστικό ανεδείχθη το χημικό μόριο ΚΑ39 λόγω της αξιοσημείωτης κυτταροστατικής και κυτταροτοξικής δράσης που προκάλεσε σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές (P<0.001). Η χορήγηση του παραγώγου ΚΑ39 οδήγησε τα καρκινικά κύτταρα σε πρώιμη και όψιμη απόπτωση και προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση S (P<0.001). Ο επαγόμενος από το παράγωγο ΚΑ39 σχηματισμός του υπερελικωμένου DNA κατά την αντίδραση χαλάρωσης του πλασμιδιακού DNA σε συνδυασμό με τη στατιστικά σημαντική μείωση στη φωσφορυλίωση της TopIIα υποδεικνύουν πώς η ΚΑ39 ανήκει στους αναστολείς TopIIα. Ακόμη, παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική αναστολή στη φωσφορυλίωση των Akt1/2 ύστερα από την επίδραση των παραγώγων ΚΑ25 και ΚΑ39 (P<0.01). Επιπλέον, η επίδραση του χημικού μορίου ΚΑ39 οδήγησε σε υπερέκφραση του ανοσορρυθμιστικού μορίου PD-L1 στα MSI-H και MSS κύτταρα. Ακόμη, προκάλεσε αποσταθεροποίηση του μηχανισμού MMR κυρίως στις MSI-H και σε μικρότερη έκταση στις MSS κυτταρικές σειρές. Τέλος, συγκρίνοντας τις ομάδες ελέγχου με τα κύτταρα που έλαβαν το παράγωγο ΚΑ39, ουδεμία μεταβολή παρατηρήθηκε στο TMB.Συμπερασματικά, από τα νέα παράγωγα των τριαζολο-[3,4-b]-θειαδιαζολίων, η χημική ένωση ΚΑ39 απεδείχθη η πιο δραστική σύμφωνα με την in vitro κυτταροστατική και κυτταροτοξική δράση που επήγαγε σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα παρόντα επιστημονικά ευρήματα δείχνουν πώς πρόκειται για ένα πιθανό φάρμακο με πολλαπλούς στόχους και σημαντική αντινεοπλασματική δράση καθώς και την ικανότητα να πυροδοτήσει την έκφραση του ανοσοσυνδέτη PD-L1 και συγχρόνως να προκαλέσει διαταραχές στη λειτουργικότητα του μηχανισμού MMR οι οποίες αποτυπώνονται στο φαινότυπο MSI. Συμπερασματικά, το παράγωγο ΚΑ39 φαίνεται να είναι ένας πολλά υποσχόμενος αντικαρκινικός παράγοντας με δυνατότητες περαιτέρω ανάπτυξης στην κλινική εφαρμογή και στην αντικαρκινική χημειο-ανοσοθεραπεία

Φαρμακολογική μελέτη της αντινεοπλασματικής δράσης νέων παραγώγων τριαζολο-[3,4-b]-1,3,4-θειαδιαζολίων

Η σύντηξη του 1,2,4-τριαζολικού δακτυλίου με τον 1,3,4-θειαδιαζολικό δακτύλιο αποτελεί μια κατηγορία θεραπευτικών παραγόντων με ευρύ φάσμα φαρμακολογικών ιδιοτήτων συμπεριλαμβανομένου της αντικαρκινικής. Οι σημαντικές δυνατότητες χημικής σύνθεσης των 1,2,4-τριαζολίων και 1,3,4-θειαδιαζολίων οδήγησαν στο σχεδιασμό και σύνθεση νέων παραγώγων 3,6 διϋποκατεστημένων 1,2,4-τριαζολο-[3,4-b]-1,3,4-θειαδιαζολίων εκ των οποίων κάποια ξεχώρισαν για την in vitro και in vivo αντικαρκινική τους δράση. Σκοπός είναι η in vitro εκτίμηση της φαρμακολογικής αντικαρκινικής δράσης νέων πρωτότυπων ενώσεων και η διαλογή των αποτελεσματικότερων εξ’ αυτών, η διερεύνηση των πρωτεϊνών που αποτελούν στόχους των υπό μελέτη παραγώγων και τέλος η in vitro αξιολόγηση των επιδράσεών τους στους προβλεπτικούς βιοδείκτες MSI (microsatellite instability), PD-L1 (programmed death ligand-1) και TMB (tumor mutation burden). Επίσης, μελετήθηκε η αποπτωτική δράση και η επίδραση των υπό μελέτη μορίων στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Για τις ανάγκες της εργασίας, χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές: πέντε παχέος εντέρου (DLD-1, HT-29, LoVo, LS174T, SW403) και δύο προστάτη (DU-145, PC-3) με διαφορετικούς MSI φαινοτύπους. Η in vitro αντινεοπλασματική δράση των παραγώγων ΚΑ25, ΚΑ26, ΚΑ39, SF29 και SF30 μελετήθηκε με τη μέθοδο MTT ενώ με τις μεθόδους χρώσης με αννεξίνη V/7-AAD και ιωδιούχο προπίδιο εκτιμήθηκε η επίδραση του μορίου ΚΑ39 στην απόπτωση και στον κυτταρικό κύκλο, αντίστοιχα. Σχετικά με την αντινεοπλασματική δράση των υπό μελέτη μορίων, διεξήχθησαν in silico υπολογιστικές μελέτες οι οποίες ανέδειξαν τις πρωτεΐνες TopIIα και Akt1/2 ως πιθανούς στόχους. Στην περίπτωση της TopIIα, η ανασταλτική επίδραση των παραγώγων ΚΑ25, ΚΑ26 και ΚΑ39 διερευνήθηκε τόσο στην καταλυτική της δραστηριότητα (plasmid-based topoisomerase II drug screening kit) όσο και στη φωσφορυλίωσή της (Human Phospho-TOP2A/Topoisomerase II Alpha Cell-Based Phosphorylation ELISA Kit). Σχετικά με τις κινάσες Akt1/2, εξετάσθηκαν τα παράγωγα ΚΑ25 και ΚΑ39 ως πιθανοί αναστολείς με τη μέθοδο της ενδοκυττάριας κυτταρομετρίας ροής. Η επίδραση του πλέον δραστικού παραγώγου ΚΑ39 στους ανοσογόνους προβλεπτικούς δείκτες, PD-L1, MSI και TMB, μελετήθηκε σε MSI-H και MSS καρκινικά κύτταρα με τη μέθοδο της εξωκυττάριας κυτταρομετρίας ροής, με PCR ανάλυση για τα πέντε συστήματα μικροδορυφόρων του πάνελ Bethesda και της στοχευμένης αλληλούχισης (Oncomine™ Tumor Mutation Load Assay), αντίστοιχα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των MTT πειραμάτων, από τα υπό μελέτη παράγωγα των τριαζολο-[3,4-b]-θειαδιαζολίων, ως πιο δραστικό ανεδείχθη το χημικό μόριο ΚΑ39 λόγω της αξιοσημείωτης κυτταροστατικής και κυτταροτοξικής δράσης που προκάλεσε σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές (P&lt;0.001). Η χορήγηση του παραγώγου ΚΑ39 οδήγησε τα καρκινικά κύτταρα σε πρώιμη και όψιμη απόπτωση και προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση S (P&lt;0.001). Ο επαγόμενος από το παράγωγο ΚΑ39 σχηματισμός του υπερελικωμένου DNA κατά την αντίδραση χαλάρωσης του πλασμιδιακού DNA σε συνδυασμό με τη στατιστικά σημαντική μείωση στη φωσφορυλίωση της TopIIα υποδεικνύουν πώς η ΚΑ39 ανήκει στους αναστολείς TopIIα. Ακόμη, παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική αναστολή στη φωσφορυλίωση των Akt1/2 ύστερα από την επίδραση των παραγώγων ΚΑ25 και ΚΑ39 (P&lt;0.01). Επιπλέον, η επίδραση του χημικού μορίου ΚΑ39 οδήγησε σε υπερέκφραση του ανοσορρυθμιστικού μορίου PD-L1 στα MSI-H και MSS κύτταρα. Ακόμη, προκάλεσε αποσταθεροποίηση του μηχανισμού MMR κυρίως στις MSI-H και σε μικρότερη έκταση στις MSS κυτταρικές σειρές. Τέλος, συγκρίνοντας τις ομάδες ελέγχου με τα κύτταρα που έλαβαν το παράγωγο ΚΑ39, ουδεμία μεταβολή παρατηρήθηκε στο TMB. Συμπερασματικά, από τα νέα παράγωγα των τριαζολο-[3,4-b]-θειαδιαζολίων, η χημική ένωση ΚΑ39 απεδείχθη η πιο δραστική σύμφωνα με την in vitro κυτταροστατική και κυτταροτοξική δράση που επήγαγε σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα παρόντα επιστημονικά ευρήματα δείχνουν πώς πρόκειται για ένα πιθανό φάρμακο με πολλαπλούς στόχους και σημαντική αντινεοπλασματική δράση καθώς και την ικανότητα να πυροδοτήσει την έκφραση του ανοσοσυνδέτη PD-L1 και συγχρόνως να προκαλέσει διαταραχές στη λειτουργικότητα του μηχανισμού MMR οι οποίες αποτυπώνονται στο φαινότυπο MSI. Συμπερασματικά, το παράγωγο ΚΑ39 φαίνεται να είναι ένας πολλά υποσχόμενος αντικαρκινικός παράγοντας με δυνατότητες περαιτέρω ανάπτυξης στην κλινική εφαρμογή και στην αντικαρκινική χημειο-ανοσοθεραπεία.The fusion of 1,2,4-triazole and 1,3,4-thiadiazole rings generated a category of therapeutic agents with a broad spectrum of pharmacological properties including anticancer. The significant chemical potentialities of 1,2,4-triazoles and 1,3,4-thiadiazoles led to the design and synthesis of new 3,6-disubstituted 1,2,4-triazolo-[3,4-b]-1,3,4-thiadiazoles derivatives some of which stood out for their in vitro and in vivo anticancer activity. The present study aims to the in vitro evaluation of the pharmacological anticancer activity of novel compounds and screening of the most effective, investigation of protein targets and finally in vitro estimation of their impact on the predictive biomarkers, MSI (microsatellite instability), PD-L1 (programmed death ligand-1) and TMB (tumor mutation burden). Additionally, the apoptotic activity and the effect on cell cycle progression induced by the most effective compound were studied. For the purpose of this study, human cancer cell lines were used: five colorectal (DLD-1, HT-29, LoVo, LS174T, SW403) and two prostate (DU-145, PC-3) with different MSI phenotypes. The in vitro antineoplastic activity of KA25, KA26, KA39, SF29, and SF30 was assessed according to MTT assay, while the effect of KA39 on apoptosis and cell cycle was determined by staining assays such as annexin V/7-AAD and propidium iodide, respectively. In the context of the antineoplastic activity of the tested compounds, in silico studies were carried out according to which TopIIα and Akt1/2 proteins constitute potential therapeutic targets. In case of TopIIα, the inhibitory effect of KA25, KA26, and KA39 was investigated both on its catalytic activity (plasmid-based topoisomerase II drug screening kit) and its phosphorylation (Human Phospho-TOP2A/Topoisomerase II Alpha Cell-Based Phosphorylation ELISA Kit). As far as it concerns Akt1/2 kinases, KA25 and KA39 were estimated as potential inhibitors by intracellular flow cytometry. The impact of the most effective derivative, KA39, on the immunogenic predictive biomarkers, PD-L1, MSI και TMB, was studied in MSI-H and MSS cancer cells according to extracellular flow cytometry, PCR analysis conducted in the five microsatellite systems of Bethesda panel and targeted sequencing (Oncomine™ Tumor Mutation Load Assay), respectively. According to MTT results, among all the tested triazolo-[3,4-b]-thiadiazoles derivatives, KA39 emerged as the most effective due to its significant cytostatic and cytotoxic activity induced in all cancer cell lines (P&lt;0.001). The administration of KA39 in cancer cells induced early and late apoptosis, as well as caused cell cycle arrest at phase S (P&lt;0.001). The KA39-induced formation of supercoiled DNA during the relaxation reaction of plasmid DNA in combination with the statistically significant reduction of TopIIα phosphorylation indicates that KA39 belongs to TopIIα inhibitors. Furthermore, a remarkable inhibition of Akt1/2 phosporylation was impelled upon treatment with KA25 and KA39 (P&lt;0.01). Moreover, the effect of KA39 triggered the overexpression of the immunoregulatory molecule, PD-L1, in MSI-H and MSS cancer cells. Additionally, the MMR mechanism was destabilized, particularly in MSI-H and to a lesser extent in MSS cancer cell lines. Finally, comparing control groups with the cells that received KA39, no alterations were observed in TMB. To conclude, among the new triazolo-[3,4-b]-thiadiazoles derivatives, the chemical compound KA39 was proved as the most effective, according to the in vitro cytostatic and cytotoxic activity induced in all the tested cancer cell lines. The current findings imply that KA39 behaves as a multitarget drug, inducing a remarkable antineoplastic activity as well as triggering the expression of the PD-L1 ligand and provoking simultaneously disorders in the functionality of the MMR mechanism, which are reflected in MSI phenotype. Conclusively, KA39 derivative seems to be a very promising anticancer agent with possibilities for further development in clinical practice and cancer chemo-immunotherapy

The Continuum of Thyroid Disorders Related to Immune Checkpoint Inhibitors: Still Many Pending Queries

Background: Until more data are available to shed light on the thyroid disorders related to immune checkpoint inhibitors (ICPi) implemented for the treatment of hematological malignancies, the decision-making is guided by pertinent data derived mostly from solid tumors. Methods: The present review provides a comprehensive and updated overview of the thyroid disorders related to ICPi, namely to inhibitors of cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4), programmed cell death (PD) 1 (PD-1), and the ligand of the latter (PD-L1). Results: With the increasing recognition of ir thyroid disorders, many outstanding issues have emerged. Ir thyroid disorders are reminiscent of, but not identical to, thyroid autoimmunity. Interclass and intraclass ICPi differences regarding thyroid immunotoxicity await interpretation. The available data concerning the predictive value of thyroid autoantibodies for the development of ir thyroid disorders are inconclusive. Mounting data indicate an association of ir thyroid disorders with ICPi efficacy, but a causative link is still lacking. The path forward is a tailored approach, entailing: (i) the validation of tumor-specific, patient-specific, and ICPi-specific predictive factors; (ii) appropriate patient selection; (iii) the uncoupling of antitumor immunity from immunotoxicity; (iv) a multidisciplinary initiative; and (v) global registry strategies. Conclusions: Untangling and harnessing the interrelationship of immuno-oncology with endocrinology underlying the ir thyroid disorders will yield the optimal patient care

The Continuum of Thyroid Disorders Related to Immune Checkpoint Inhibitors: Still Many Pending Queries

Simple Summary: To capitalize on the revolutionary anticancer efficacy of immune checkpoint inhibitors (ICPi) in an expanding list of tumors, including hematological malignancies, it is mandatory to mitigate the immune-related (ir) adverse events, among which prevail the ir thyroid disorders. Currently, most available data on ir thyroid disorders are derived from solid tumors. Our review provides a comprehensive and updated overview of ir thyroid disorders, dissecting several intriguing issues, namely: (i) the elusive biological background, (ii) the epidemiological profile, (iii) the clinical spectrum, (iv) the diagnostic and therapeutic algorithms, (v) the predictive value of antithyroid antibodies for the development of ir thyroid disorders, and (vi) the prognostic significance. To contribute to the decision-making, this review provides an on-hand presentation of the latest reviews, meta-analyses, and pharmacovigilance studies addressing ir thyroid disorders, as well as of the most widely applied treatment guidelines. The current challenges and future perspectives, as regards a tailored approach to ir thyroid disorders, are critically discussed. Background: Until more data are available to shed light on the thyroid disorders related to immune checkpoint inhibitors (ICPi) implemented for the treatment of hematological malignancies, the decision-making is guided by pertinent data derived mostly from solid tumors. Methods: The present review provides a comprehensive and updated overview of the thyroid disorders related to ICPi, namely to inhibitors of cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4), programmed cell death (PD) 1 (PD-1), and the ligand of the latter (PD-L1). Results: With the increasing recognition of ir thyroid disorders, many outstanding issues have emerged. Ir thyroid disorders are reminiscent of, but not identical to, thyroid autoimmunity. Interclass and intraclass ICPi differences regarding thyroid immunotoxicity await interpretation. The available data concerning the predictive value of thyroid autoantibodies for the development of ir thyroid disorders are inconclusive. Mounting data indicate an association of ir thyroid disorders with ICPi efficacy, but a causative link is still lacking. The path forward is a tailored approach, entailing: (i) the validation of tumor-specific, patient-specific, and ICPi-specific predictive factors; (ii) appropriate patient selection; (iii) the uncoupling of antitumor immunity from immunotoxicity; (iv) a multidisciplinary initiative; and (v) global registry strategies. Conclusions: Untangling and harnessing the interrelationship of immuno-oncology with endocrinology underlying the ir thyroid disorders will yield the optimal patient care

Azasteroid Alkylators as Dual Inhibitors of AKT and ERK Signaling for the Treatment of Ovarian Carcinoma

(1) Background: Previous findings show that lactam steroidal alkylating esters display improved therapeutic efficacy with reduced toxicity. The aim of this study was to evaluate the anticancer activity of two newly synthesized aza-steroid alkylators (ENGA-L06E and ENGA-L08E) against human ovarian carcinoma cells, and consequently, the dual inhibition of RAS/PI3K/AKT and RAS/RAF/MEK/ERK signaling pathways, both of which are closely associated with ovarian cancer; (2) Methods: The in vitro cytostatic and cytotoxic effects of ENGA-L06E and ENGA-L08E were evaluated in a panel of five human ovarian cancer cell lines, as well as in in vivo studies. ENGA-L06E and ENGA-L08E, in addition to another two aniline-mustard alkylators, POPAM and melphalan (L-PAM), were utilized in order to determine the acute toxicity and antitumor efficacy on two human ovarian xenograft models. Also, in silico studies were performed in order to investigate the dual inhibition of ENGA-L06E and ENGA-L08E on RAS/PI3K/AKT and RAS/RAF/MEK/ERK signaling pathways; (3) Results: Both, in vitro and in vivo studies demonstrated that ENGA-L06E and ENGA-L08E were significantly more effective with a lower toxicity profile in comparison to POPAM and L-PAM alkylators. Moreover, in silico studies demonstrated that the two new aza-steroid alkylators could act as efficient inhibitors of the phosphorylation of AKT and ERK1/2 molecules; and (4) Conclusions: Both ENGA-L06E and ENGA-L08E demonstrated high anticancer activity through the inhibition of the PI3K-AKT and KRAS-ERK signaling pathways against human ovarian carcinoma, and thus constituting strong evidence towards further clinical development

Anticancer Activity of Triazolo-Thiadiazole Derivatives and Inhibition of AKT1 and AKT2 Activation

The fusion of 1,2,4-triazole and 1,3,4-thiadiazole rings results in a class of heterocycles compounds with an extensive range of pharmacological properties. A series of 1,2,4-triazolo[3,4-b]-1,2,4-thiadiazoles was synthesized and tested for its enzyme inhibition potential and anticancer activity. The results show that 1,2,4-triazolo[3,4-b]-1,2,4-thiadiazoles display potent anticancer properties in vitro against a panel of cancer cells and in vivo efficacy in HT-29 human colon tumor xenograft in CB17 severe combined immunodeficient (SCID) mice. Preliminary mechanistic studies revealed that KA25 and KA39 exhibit time- and concentration-dependent inhibition of Akt Ser-473 phosphorylation. Molecular modeling experiments indicated that 1,2,4-triazolo[3,4-b]-1,2,4-thiadiazoles bind well to the ATP binding site in Akt1 and Akt2. The low acute toxicity combined with in vitro and in vivo anticancer activity render triazolo[3,4-b]thiadiazoles KA25, KA26, and KA39 promising cancer therapeutic agents

Discovery of steroidal lactam conjugates of POPAM-NH2 with potent anticancer activity

Aim: Steroidal prodrugs of nitrogen mustards such as estramustine and prednimustine have proven effective anticancer agents in clinical use since the 1970s. In this work, we aimed to develop steroidal prodrugs of the novel nitrogen mustard POPAM-NH2. POPAM-NH2 is a melphalan analogue that was coupled with three different steroidal lactams. Methodology: The new conjugates were preclinically tested for anticancer activity against nine human and one rodent cancer experimental models, in vitro and in vivo. Results &amp; conclusion: All the steroidal alkylators showed high antitumor activity, in vitro and in vivo, in the experimental systems tested. Moreover, these hybrid compounds showed by far superior anticancer activity compared with the alkylating agents, melphalan and POPAM-NH2. [GRAPHICS]

Cytocidal Antitumor Effects against Human Ovarian Cancer Cells Induced by B-Lactam Steroid Alkylators with Targeted Activity against Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) Enzymes in a Cell-Free Assay

We evaluated three newly synthesized B-lactam hybrid homo-aza-steroidal alkylators (ASA-A, ASA-B and ASA-C) for their PARP1/2 inhibition activity and their DNA damaging effect against human ovarian carcinoma cells. These agents are conjugated with an alkylating component (POPA), which also served as a reference molecule (positive control), and were tested against four human ovarian cell lines in vitro (UWB1.289 + BRCA1, UWB1.289, SKOV-3 and OVCAR-3). The studied compounds were thereafter compared to 3-AB, a known PARP inhibitor, as well as to Olaparib, a standard third-generation PARP inhibitor, on a PARP assay investigating their inhibitory potential. Finally, a PARP1 and PARP2 mRNA expression analysis by qRT-PCR was produced in order to measure the absolute and the relative gene expression (in mRNA transcripts) between treated and untreated cells. All the investigated hybrid steroid alkylators and POPA decreased in vitro cell growth differentially, according to the sensitivity and different gene characteristics of each cell line, while ASA-A and ASA-B presented the most significant anticancer activity. Both these compounds induced PARP1/2 enzyme inhibition, DNA damage (alkylation) and upregulation of PARP mRNA expression, for all tested cell lines. However, ASA-C underperformed on average in the above tasks, while the compound ASA-B induced synthetic lethality effects on the ovarian cancer cells. Nevertheless, the overall outcome, leading to a drug-like potential, provides strong evidence toward further evaluation