High Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology.

OBJECTIVES:We have developed a relevant preclinical model associated with a specific imaging protocol dedicated to onco-pharmacology studies in mice. MATERIALS AND METHODS:We optimized both the animal model and an ultrasound imaging procedure to follow up longitudinally the lung tumor growth in mice. Moreover we proposed to measure by photoacoustic imaging the intratumoral hypoxia, which is a crucial parameter responsible for resistance to therapies. Finally, we compared ultrasound data to x-ray micro computed tomography and volumetric measurements to validate the relevance of this approach on the NCI-H460 human orthotopic lung tumor. RESULTS:This study demonstrates the ability of ultrasound imaging to detect and monitor the in vivo orthotopic lung tumor growth by high resolution ultrasound imaging. This approach enabled us to characterize key biological parameters such as oxygenation, perfusion status and vascularization of tumors. CONCLUSION:Such an experimental approach has never been reported previously and it would provide a nonradiative tool for assessment of anticancer therapeutic efficacy in mice. Considering the absence of ultrasound propagation through the lung parenchyma, this strategy requires the implantation of tumors strictly located in the superficial posterior part of the lung

Plasmas froids pour des applications thérapeutiques

National audienceL’association plasmas froids et biologie n’est pas spécialement nouvelle (on peut rappeler que l’une des premières applications industrielles des plasmas a été la production d’ozone pour la désinfection de l’eau au début du siècle dernier), mais elle a pris un cours particulièrement intéressant ces dernières années au point qu’un nouveau champ de recherche est apparu : Plasma Medicine. Dans un premier temps, au cours des deux dernières décennies, de nombreuses équipes à travers le monde ont démontré de très intéressantes applications des plasmas froids hors équilibre (PFHE) dans les domaines de la stérilisation et de la décontamination, montrant là tout l’intérêt des interactions des plasmas avec le vivant. Dans un deuxième temps, beaucoup plus récemment, il a été montré que ces plasmas pouvaient présenter un intérêt énorme pour des applications thérapeutiques. L’engouement suscité par les recherches concernant les applications biomédicales des plasmas s’est récemment encore amplifié au point que de nombreuses conférences et workshops spécifiques ont été organisés en plus de sessions spécialisées dans tous les grands symposiums ou conférences plasmas. De même des numéros spéciaux de journaux ont été édités [1,2,3]. Une conférence internationale « International Conference on Plasma Medicine », ICPM, incluant aussi les procédés plasmas qui concernent les biomatériaux et l’ingénierie des tissus, a vu le jour en octobre 2007 aux USA, suivie par une seconde au printemps 2009, la troisième se déroulant en septembre de cette année à Greifswald en Allemagne. Parallèlement, un très récent rapport [4] du National Research Council of the National Academies of USA « Plasma Science, Advancing Knowledge in the National Interest » réalisé par le Plasma 2010 Committee, souligne l’extrême importance que les plasmas devraient prendre dans les Biotechnologies et la Médecine dans les années à venir. Ces domaines font partie des « Selected highlights » et sont présentés comme des domaines à très fort potentiel. Jusqu’à un passé très récent, les technologies plasmas avaient trouvé relativement peu d’applications dans le médical alors que de nombreuses avancées technologiques basées sur l’exploitation de divers phénomènes physiques, incluant lasers, RF et microondes, stimulation électrique et magnétique, ultrasons, rayonnements ionisants et beaucoup d’autres encore, ont transformé la pratique moderne de la médecine. Les avancées récentes réalisées dans le contrôle des plasmas froids hors équilibre, associées au fait que ces PFHE à l’air libre pouvaient efficacement traiter des tissus vivants sans les endommager, ont vraiment conduit à l’émergence de ce nouveau champ d’application des procédés plasmas qu’est la « Médecine Plasma », domaine particulièrement pluridisciplinaire impliquant plasmiciens, biologistes, biochimistes, médecins et ingénieurs. Les derniers développements dans le domaine montrent que de très nombreuses applications pourront être abordées. Cela concernent aussi bien le la coagulation du sang [5] ou la prévention du développement de bactéries sur des organes opérés, que les soins sur des plaies persistantes ou des ulcères [6], le traitement de cellules cancéreuses [7,8] ou de tumeurs [9] pour ne citer que ces quelques exemples. On doit aussi bien sûr mentionner tout ce qui concerne la prévention des infections au travers de l’éradication des organismes pathogènes qui se trouvent dans l’environnement immédiat du patient (corps et organes, instruments, air), applications liées à la stérilisation et décontamination [10]. A l’opposé des plasmas thermiques qui sont employés occasionnellement en médecine, par exemple pour l’électrocautérisation, l’hemostase ou la coupe de tissus [11], les PFHE offrent une plus grande flexibilité et permettent de créer des conditions préservant les tissus sains pour des traitements présentant a priori une meilleure sélectivité. L’activité des plasmas non-thermiques peut être a priori ajustée en adaptant les propriétés des plasmas générés en faisant varier les proportions de radicaux, d’espèces excitées, d’ions ou d’électrons et les flux de photons, principalement UV dont la production doit être extrêmement contrôlée [12] et aussi la maîtrise de la température au niveau de l’échantillon biologique . Les travaux n’en sont qu’à leurs débuts et les résultats observés sont dans la plupart des cas mal compris et les mécanismes d’actions très mal identifiés. Il existe un besoin énorme de travaux expérimentaux et de modélisation pour permettre de clarifier les modes d’actions des PFHE et des effets des diverses espèces présentes dans le plasma, notamment des ions, dans les divers traitements. En parallèle, des travaux plus fondamentaux sur les interactions espèces réactives/molécules d’intérêt biologiques doivent être poursuivis [13]. Un effort considérable est actuellement fait dans la plupart des grands pays industrialisés, Allemagne, USA, Japon, Russie, Grande Bretagne, pour rapprocher les communautés concernées et mettre en place des structures adaptées à l’instar de « Campus PlasmaMed » en Allemagne, qui regroupe l’INP-Greifswald, les universités de Greifswald et Rostock, et les deux universités des sciences appliquées de Stralsund et Neubrandenburg. En France, la communauté s’est rassemblée dans un GDR, ABioPLas, Applications Biomédicales des Plasmas, créé début 2010. Ce GDR devrait permettre de favoriser et renforcer les collaborations dans ce domaine où les laboratoires français sont particulièrement bien représentés.A côté des applications proprement dites, il existe un effort considérable pour le développement de nouveaux systèmes de décharges ou post décharge [14] permettant l’obtention de PFHE appropriés. Dans ce contexte, est apparu un certain nombre de développements concernant des générateurs de plasmas à la pression atmosphériques (Décharges à barrière diélectrique à potentiel flottant (FE-DBD), « aiguille plasma », jets de plasma) [8, 15, 16]. Dans la plupart des cas, les décharges générant les milieux plasmas sont créées à faible distance de la surface à traiter (~mm), soit à cause du type même de décharge (c’est le cas par exemple des décharges à barrière diélectrique, DBD) ou à cause de l’extinction rapide du plasma se propageant dans l’air (plume plasma DBD, aiguille plasma RF). Dans nombre de cas, il existe un intérêt évident pour la génération de plasmas à distance permettant de séparer la zone de décharge (utilisation de haute tension) et la cible à traiter. La mise au point du système Plasma gun [17], qui permet de générer des balles de plasmas sur des distances allant de quelques centimètres à plusieurs dizaines de centimètres, va peut-être permettre d’apporter une première réponse à ce problème. Après une introduction générale du sujet, la première partie de la présentation sera consacrée aux derniers développements à travers le monde concernant les applications biomédicales des plasmas et plus particulièrement les applications à la médecine, ainsi que la structuration des communautés concernées dans les principaux pays où ce domaine connaît une activité significative. La deuxième partie sera consacrée plus spécifiquement aux travaux effectués à Orléans dans le cadre du programme « Plasmed », consacré à l’étude des applications thérapeutiques des plasmas dans les domaines de la cancérologie et de la dermato-cosmétologie, avec des réacteurs FE-DBD et Plasma gun, in vitro et in vivo sur des souris (études de tolérance, efficacité antitumorale in-vitro, activation de facteurs de transcription, induction de l’apoptose, activité antitumorale in-vivo). D’ores et déjà, des résultats très encourageants ont été obtenus in vivo [9,18], montrant une activité antitumorale des plasmas dans le cas de glyoblastomes greffés (cellules tumorales U87-Luc humaines). Cette présentation sera aussi l’occasion de faire le point sur les nouvelles décharges mises en œuvre par diverses équipes, en particulier les jets de plasma à la pression atmosphérique et les « plasma gun » tels que ceux développés au GREMI.Références [1] Plasma Processes and Polymers, 3 (2006), Plasma Processes and Polymers, 5 (2008)[2] Plasma Process. Polym., 7 (2010)[3] Plasma Medicine J., 1, 1 (2010)[4] Plasma Science, Advancing Knowledge in the National Interest, Report of the National Research Council of the National Academies of USA, (Winter 2007)[5] M.Balasubramanian, ,A. Sebastian, M. Peddinghaus, G. Fridman, A. Fridman, A. Gutsol, G. Friedman, andB. Ari. Blood 108(11):89b-89b, (2006)[6] GLloyd, G Friedman, SJafri, G Schultz, AFridman, Keith Harding Plasma Process. Polym., 7, 194 (2010)[7] G C Kim, G J Kim, S R Park, S M Jeon, H J Seo, F Iza and J K Lee, J. Phys. D: Appl. Phys. 42 (2009) 032005[8] G Fridman, A Shereshevsky, MM Jost, et al., Plasma Chem. Plasma Process., 27, 163 (2007)[9] M. Vandamme, E. Robert, S. Pesnel, E. Barbosa, S. Dozias, J. Sobilo, S. Lerondel, A. Le Pape, J.-M. Pouvesle, Plasma Process. Polym., 7, 264 (2010)[10] M. Laroussi, IEEE Trans. Plas. Sci., 30, 1409 (2002)[11] J. J.Vargo, Gastrointest. Endosc. 59(1):81–88, 2004 [12] T Shimizu, T Nosenko, GE Morfill, T Sato, Hans-Ulrich Schmidt, Takuya Urayama, Plasma Process. Polym., 7, 288 (2010)[13] JS Sousa, G Bauville, B Lacour, V Peuch, M Touzeau, EPJ-AP 47, 22807 (2009)[14] E. Panousis, F. Clement, E. Lecoq, IEEE Trans. Plas. Sci. 36, 1338 (2008)[15] Kieft IE, Darios D, Roks AJM, Stoffels E, IEEE Trans. Plas. Sci., 33, 771 (2005)[16] X. Lu, M. Laroussi, J. Appl. Phys., 100, 063302 (2006)[17] E. Robert, E. Barbosa, S. Dozias, M. Vandamme, C. Cachoncinlle, R. Viladrosa, J.-M. Pouvesle, Plasma Process. Polym., 6, 795 (2009)[18] M. Vandamme, E. Robert, S. Dozias, J. Sobilo, S. Lerondel, A. Le Pape, J.-M. Pouvesle, Plasma Medicine J., 1, 1 (2010) in press

In vitro and in vivo antitumor effect of non thermal plasma

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Biomedical Applications of non-equilibrium low temperature plasmas

International audienceOver the past two decades, many teams around the world demonstrated very interesting applications of non equilibrium cold plasmas in the domains of sterilization and decontamination. Recently, researchers have shown that this kind of plasmas are of huge interest in medicine, more especially for haemostasis (control of bleeding during surgery), skin diseases, and stomatology. As opposed to thermal plasmas which are employed in medicine for electrocauterization, haemostasis or tissue cutting, non-thermal plasmas have much greater flexibility and can create much more subtle non-lethal effects permitting substantial selectivity in treatment. Our very recent work showed that non equilibrium cold plasmas at atmospheric pressure are clearly also very promising for the treatment of certain types of tumors. Medical applications of plasmas have known spectacular developments these last few years.In Orleans, an important project “Plasmed” dedicated to the study of therapeutic applications of plasmas in cancerology and dermato-cosmetology, gather together plasma researchers, biologists, medical doctors and partners from companies. Already, very interesting results have been obtained in vivo, showing plasma antitumor effect on human U87-Luc glyoblastoma (brain tumor). In this study, Balb/c nude female mice were injected sub cutaneously with U87 tumor cells previously transfected by the luciferase gene. The experiments were performed using a pulsed floating electrode DBD plasma reactor driven by an adjustable power supply allowing plasma treatments over a wide range of parameters concerning applied voltage and discharge frequency up to one kHz. Bioluminescence (BLI), a gene expression imaging modality that is closely dependant upon metabolism and proliferation, was used to assess tumor growth. Results indicate that a very substantial delay in tumor grow is initiated for plasma treated tumors compared to non-treated ones. This work is done is close collaboration with CIPA (Small Animal Imaging Center) from TAAM Lab. In this paper, after a general introduction on current plasma biomedical developments, especially plasma medicine, we will focus on the work performed at GREMI in collaboration with CIPA-TAAM laboratory and other local labs, CBM and IEM. We will report on in vitro and vivo experiments on Balb/c nude and C57 Bl-6 mice (tolerance study, antitumor efficacy in vitro, transcription factor activation, tumor oxygenation, antitumor activity in vivo). We will then emphasize on the developments concerning new atmospheric plasma discharges, plasma jets and “plasma gun”, as the one developed in the lab, of interest for future biomedical applications of cold non-equilibrium plasmas

Effets de la congélation sur la microstructure de tourbes. Apport de la micro- tomographie X à révéler tels effets de congélation.

International audienceThe impact of freezing on Sphagnum and Sphagnum Molinia decomposed peats was estimated from their morphological alterations in pore structure computed from 3D CT scanning images. This study investigates how the freeze during peat samples preparing in laboratory affects pore structure, using high-resolution (100 and 60μm) three-dimensional (3D) X-ray computed tomography (CT) and digital image processing of two peats sampled at a certain depths. Our results show that while the freezing technique is more and more frequently used, it alters the structure of the two peat materials studied. Not only tubular pores with a larger diameter were partially altered but many smaller pores also were produced by freezing. The later might be produced by the formation of ice crystals of similar size within the porous organic matrix water saturated or, as suggested by their 3D distribution, by the crystallization of the water in tubular pore too small to be identified before freezing with the X-ray microtomography used in this study but, after freezing, large enough discontinuously after ice crystals formation and their growth by water migration from the surrounding porous and water saturated organic matrix. Whatever le formation mechanism of these new pores visible after freezing on the 3D CT scanning images, our results show that the freezing technique is to be used with great care when the objective is to study the structure of peat materials, and that for peat materials similar to those studied here, it should be avoided.Les tourbes résultent d'une accumulation nette de la matière organique dans des contextes de bilan hydrique positif conduisant à un excès d'eau permanent. Ainsi, on enregistre une accumulation de la biomasse végétale produite chaque année par la photosynthèse, cette biomasse s'accumule plus rapidement qu'elle ne se décompose, (Limpens et al., 2008, Bragazza, 2008). La tomographie X, souvent appliquée pour le diagnostic médical, l'est aussi pour l'étude des tourbes depuis des années pour la connaissance de leur structure. Peu d'études portant sur les propriétés physique (porosité, densité apparente et degré de décomposition) et hydrauliques (rétention en eau et conductivité hydraulique) des tourbes ont été effectuées. Certaines d'entre elles mettent en oeuvre la tomographie X sur des échantillons de taille très variable (entre 100 et 200 cm 3), (Quinton et al., 2009, Rezanezhad et al., 2010, Turberg et al., 2014). Plus récemment, de telles études ont cherché à préciser la structure fine des tourbes (organisation des débris organiques et géométrie des vides qui en résulte) afin de mieux comprendre les propriétés physico-hydriques en mettant en oeuvre la micro-tomographie X à haute résolution (Gerke et al., 2012 ; Rezanezhad et al., 2016). Objectif : La caractérisation de matériaux tourbeux par la micro-tomographie X nécessite, pour minimiser la perturbation structurale lors de la préparation des échantillons qui se doivent d'être de petite taille, un protocole conduisant à congeler l'échantillon afin de le découper à l'état solide avant qu'il ne soit scanné. Cette étude a pour objectif de vérifier si la congélation d'échantillons de tourbe, avant leur analyse en micro-tomographie X, provoque une modification de sa structure originelle. Matériel et méthodes : Plusieurs échantillons de deux types de tourbe (tourbe à Sphaigne et à Molinie) ont été prélevés dans deux sites appartenant Service National d'Observations Tourbières (D'Angelo et al., 2016). Pour chaque bloc (15x15 cm² et 40 cm de profondeur) et selon le degré de décomposition de la tourbe, 6 tranches de 5 cm de long ont été découpées. Des mesures physico-hydriques (densité apparente, porosité et teneur en eau) ont été réalisées. Des sous-échantillons (5 cm de diamètre et 7 cm de long) ont été analysés en micro-tomographie X, puis congelés à-10 C° pendant 48h, décongelés sans que la teneur en eau ne varie, et analysés à nouveau en micro-tomographie X avec une résolution de 50-60 µm

Rôles des ROS dans l’effet anti-tumoral des plasmas froids

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Evaluation par imagerie de bioluminescence de l’inflammation induite par le plasma froid en utilisant une souris transgénique NF-kB-luc

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Antitumor activity of non-thermal plasma: mechanisms analyses and preliminary approach using micro endoscopic plasma gun

International audienceBackgroundOur group has recently showed a marked antitumor effect of DBD plasma treatment on U87glioma bearing mice. Beside these results in vivo, various studies have showed an antitumor effect ofplasma treatment on various cancer cells lines in vitro by apoptosis induction using DBD or plasmajet. Based on these interesting properties, non-thermal plasma appears to be a potential new antitumorstrategy for different tumor type. The main goal of this work was to investigate the in vitro and in vivoplasma induced cell death mechanisms and to assess the possibility of lung in situ treatment usingplasma gun.MethodsExperiments were performed using a floating electrode DBD plasma reactor and the plasmagun previously described by our group. Antitumor activity was evaluated on U87 or HCT116 cancercells previously transfected by the luciferase gene. U87 is a representative glioma model with a highchemo and radio resistance and HCT-116 is a colorectal carcinoma model which is a potential futuretarget for in situ plasma application. In vitro effects of plasma treatment on proliferation, viability andapoptosis were assessed by bioluminescence imaging (BLI) and flow cytometer analyses withpropidium iodide, annexin V or Brdu staining.In vivo DBD plasma treatments were performed on tumors heterotopically implanted in nudemice. Treatment effects on tumor cells proliferation and apoptosis were assessed by BLI, histologyand by flow cytometer analyses. Plasma gun was used for lung treatment. To this end, trachealintubation of the mouse with small diameter capillary was performed and a very low gas flow wasused. Evaluation of plasma tolerance on lung tissue was done using a NF-kB-luc reported mouse. NFkBis a transcription factor implied in the induction of inflammation process and imaging of thisreported mouse by bioluminescence imaging (BLI) allows the monitoring of inflammationResults and DiscussionPlasma treatment induced a significant antitumor effect on U87 and HCT116 cells in vitro andin vivo. Plasma also induced apoptosis in vitro and in vivo. This antitumor effect was associated toDNA damages leading to a cell cycle arrest and cell death induction by ROS generation in the vicinityof the cells.In lung tissue, plasma gun application was successfully achieved since tracheal intubation withsmall capillary and use of low gas flow were well tolerated by the mouse, only a slight modification ofthe mouse breathing even with the presence of rare gas flow was observed. These results allow us toconsider and to evaluate the interest of the plasma gun for the in situ treatment of lung tumor orbronchial dysplasia.This work is supported through the APR Région Centre “Plasmed”, V.S. is supported by le ConseilGénéral du Loiret and DR is supported by Region Centre and CNR

Stimulation of olfactory receptors in cancer cells exacerbates their invasiveness and propensity to generate metastases

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Novel Bispidine-based Mn(II) complexes for PET/MR Imaging

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