Biophysikalischer Einfluss von Kv6.1-, Kv6.3- und Kv6.4-Proteinen auf den spannungsabhängigen Kaliumkanal Kv2.1

Zusammenfassung Spannungsabhängige Kaliumkanäle (Kv) nehmen Schlüsselfunktionen bei wichtigen physiologischen Prozessen in unterschiedlichsten Zelltypen ein. Zu diesen Prozessen gehören unter anderem die Bildung des Membranpotentials, die Erregbarkeit von Zellen oder der Ablauf des Aktionspotentials. Ein funktionsfähiger Kaliumkanal setzt sich dabei immer aus vier Untereinheiten zusammen und obwohl zahlreiche dieser Untereinheiten bekannt sind, besitzen nur relativ wenige von ihnen die Fähigkeit selbständig ein Tetramer zu formen. Bausteine dieser Art werden als α-Untereinheiten bezeichnet. Im Gegensatz hierzu können sich die sogenannten γ-Untereinheiten nur in Kombination mit α-Untereinheiten am Kanalaufbau beteiligen. Es wird angenommen, dass diese Heteromultimerisierung aus α- und γ-Proteinen das elektrophysiologische Verhalten des Kanals an die unterschiedlichen Anforderungen in den verschiedenen Zellen anpasst. Der genaue Ablauf der heteromeren Kanalbildung und die modifizierende Potenz vieler γ-Proteine sind bislang jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Auswirkungen von drei dieser modifizierenden γ-Proteine (Kv6.1, Kv6.3 und Kv6.4) auf die grundlegenden biophysikalischen Eigenschaften des humanen spannungsabhängigen Kaliumkanals hKv2.1 mit elektrophysiologischen Methoden näher untersucht. Das Aktivierungs-, Inaktivierungs- und Deaktivierungsverhalten wurde nach transienter Transfektion der cDNA von Kv2.1, Kv6.1, Kv6.3 und Kv6.4 in CHO-K1-Zellen mit Hilfe der patch-clamp-Technik analysiert. Da die γ-Proteine nicht in der Lage sind selbständig funktionsfähige Ionenkanäle zu bilden, zeigte sich bei Monotransfektion erwartungsgemäß keine eigenständige elektrische Aktivität. Bei Kotransfektion mit hKv2.1-Genen beteiligten sich die Kv6-Untereinheiten jedoch am Kanalaufbau und nahmen Einfluss auf das biophysikalische Verhalten des Ionenkanals. So wiesen die heteromeren Kanalkonstrukte von hKv2.1 mit Kv6.1, Kv6.3 oder Kv6.4 jeweils eigenständige elektrophysiologische Charakteristika auf, die sich von den Eigenschaften des homotetrameren hKv2.1-Kanals teils deutlich unterschieden. Zusammenfassend ergab sich für die hier untersuchten Mitglieder der Kv6-Familie folgendes Bild: 1.) Sie können keine homotetrameren Ionenkanäle bilden. 2.) Zusammen mit hKv2.1 entstehen funktionsfähige heteromere Kanalproteine. 3.) Die elektrophysiologischen Eigenschaften wie Aktivierung, Deaktivierung und Inaktivierung der Heteromere unterscheiden sich deutlich von den hKv2.1-Charakteristika. 4.) Die Kanalvielfalt und –funktionsweise wird durch heteromultimeren Aufbau beträchtlich erweitert. 5.) Zellen können sich mit diesen modifizierten Kanalkomplexen an die unterschiedlichen Anforderungen und Aufgaben in den verschiedenen Organen anpassen. 6.) Die Aufgaben der Kv6-Familie entsprechen daher einer regulatorischen und modifizierenden Komponente. Desweiteren wurden neue Erkenntnisse über den Vorgang der Multimerisierung gewonnen. Erkennung und Assemblierung der einzelnen Untereinheiten eines spannungsabhängigen Kaliumkanals zum arbeitenden Ionenkanal werden spezifisch über die sogenannte T1-Domäne mit der hochkonservierten Aminosäuresequenz HX5CX20CC vermittelt. Experimente mit dem Kanal hKv2.1H105V, bei dem die Aminosäure Histidin an der Position 105 durch Valin mittels gezielter Mutagenese ersetzt wurde, lieferten folgendes Ergebnis: Obwohl eine Tetramerisierung zum arbeitenden Kanal trotz Punktmutation möglich war, konnten sich Kv6.4-Untereinheiten nicht mehr daran beteiligen. Die Stromkinetik des hKv2.1H105V wurde anders als beim Wildtyp hKv2.1 durch Kotransfektion mit dem Kv6.4-Protein nicht verändert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aminosäure Histidin im HX5CX20CC-Motiv für die Bildung von Heteromultimeren aus α- und γ-Proteinen eine essentielle Rolle spielt, während die Bildung von homotetrameren Kanälen, die nur aus α-Untereinheiten zusammengesetzt sind weiterhin möglich ist und unabhängig von Histidin verläuft. Diese Erkenntnisse liefern einen wichtigen Beitrag zum besseren Verständnis sowohl des Vorgangs als auch der Bedeutung der Multimerisierung bei spannungsabhängigen Kaliumkanälen

Biophysikalischer Einfluss von Kv6.1-, Kv6.3- und Kv6.4-Proteinen auf den spannungsabhängigen Kaliumkanal Kv2.1

Zusammenfassung Spannungsabhängige Kaliumkanäle (Kv) nehmen Schlüsselfunktionen bei wichtigen physiologischen Prozessen in unterschiedlichsten Zelltypen ein. Zu diesen Prozessen gehören unter anderem die Bildung des Membranpotentials, die Erregbarkeit von Zellen oder der Ablauf des Aktionspotentials. Ein funktionsfähiger Kaliumkanal setzt sich dabei immer aus vier Untereinheiten zusammen und obwohl zahlreiche dieser Untereinheiten bekannt sind, besitzen nur relativ wenige von ihnen die Fähigkeit selbständig ein Tetramer zu formen. Bausteine dieser Art werden als α-Untereinheiten bezeichnet. Im Gegensatz hierzu können sich die sogenannten γ-Untereinheiten nur in Kombination mit α-Untereinheiten am Kanalaufbau beteiligen. Es wird angenommen, dass diese Heteromultimerisierung aus α- und γ-Proteinen das elektrophysiologische Verhalten des Kanals an die unterschiedlichen Anforderungen in den verschiedenen Zellen anpasst. Der genaue Ablauf der heteromeren Kanalbildung und die modifizierende Potenz vieler γ-Proteine sind bislang jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Auswirkungen von drei dieser modifizierenden γ-Proteine (Kv6.1, Kv6.3 und Kv6.4) auf die grundlegenden biophysikalischen Eigenschaften des humanen spannungsabhängigen Kaliumkanals hKv2.1 mit elektrophysiologischen Methoden näher untersucht. Das Aktivierungs-, Inaktivierungs- und Deaktivierungsverhalten wurde nach transienter Transfektion der cDNA von Kv2.1, Kv6.1, Kv6.3 und Kv6.4 in CHO-K1-Zellen mit Hilfe der patch-clamp-Technik analysiert. Da die γ-Proteine nicht in der Lage sind selbständig funktionsfähige Ionenkanäle zu bilden, zeigte sich bei Monotransfektion erwartungsgemäß keine eigenständige elektrische Aktivität. Bei Kotransfektion mit hKv2.1-Genen beteiligten sich die Kv6-Untereinheiten jedoch am Kanalaufbau und nahmen Einfluss auf das biophysikalische Verhalten des Ionenkanals. So wiesen die heteromeren Kanalkonstrukte von hKv2.1 mit Kv6.1, Kv6.3 oder Kv6.4 jeweils eigenständige elektrophysiologische Charakteristika auf, die sich von den Eigenschaften des homotetrameren hKv2.1-Kanals teils deutlich unterschieden. Zusammenfassend ergab sich für die hier untersuchten Mitglieder der Kv6-Familie folgendes Bild: 1.) Sie können keine homotetrameren Ionenkanäle bilden. 2.) Zusammen mit hKv2.1 entstehen funktionsfähige heteromere Kanalproteine. 3.) Die elektrophysiologischen Eigenschaften wie Aktivierung, Deaktivierung und Inaktivierung der Heteromere unterscheiden sich deutlich von den hKv2.1-Charakteristika. 4.) Die Kanalvielfalt und –funktionsweise wird durch heteromultimeren Aufbau beträchtlich erweitert. 5.) Zellen können sich mit diesen modifizierten Kanalkomplexen an die unterschiedlichen Anforderungen und Aufgaben in den verschiedenen Organen anpassen. 6.) Die Aufgaben der Kv6-Familie entsprechen daher einer regulatorischen und modifizierenden Komponente. Desweiteren wurden neue Erkenntnisse über den Vorgang der Multimerisierung gewonnen. Erkennung und Assemblierung der einzelnen Untereinheiten eines spannungsabhängigen Kaliumkanals zum arbeitenden Ionenkanal werden spezifisch über die sogenannte T1-Domäne mit der hochkonservierten Aminosäuresequenz HX5CX20CC vermittelt. Experimente mit dem Kanal hKv2.1H105V, bei dem die Aminosäure Histidin an der Position 105 durch Valin mittels gezielter Mutagenese ersetzt wurde, lieferten folgendes Ergebnis: Obwohl eine Tetramerisierung zum arbeitenden Kanal trotz Punktmutation möglich war, konnten sich Kv6.4-Untereinheiten nicht mehr daran beteiligen. Die Stromkinetik des hKv2.1H105V wurde anders als beim Wildtyp hKv2.1 durch Kotransfektion mit dem Kv6.4-Protein nicht verändert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aminosäure Histidin im HX5CX20CC-Motiv für die Bildung von Heteromultimeren aus α- und γ-Proteinen eine essentielle Rolle spielt, während die Bildung von homotetrameren Kanälen, die nur aus α-Untereinheiten zusammengesetzt sind weiterhin möglich ist und unabhängig von Histidin verläuft. Diese Erkenntnisse liefern einen wichtigen Beitrag zum besseren Verständnis sowohl des Vorgangs als auch der Bedeutung der Multimerisierung bei spannungsabhängigen Kaliumkanälen