Untersuchung von früh-endosomalem 'sorting' und 'budding'

Frühe Endosomen stellen eine wichtige Sortierstation in eukaryotischen Zellen dar. Sie empfangen Transportvesikel von der Plasmamembran und vom Golgi Apparat und sortieren die darin enthaltene membrangebundene und lösliche Ladung zu verschiedenen intrazellulären Organellen. Somit sind Fusion von Transportvesikeln, Sortierung ihres Inhalts und Abschnürung von neuen Vesikeln die elementaren Funktionen von frühen Endosomen. Während endosomale Fusion gut charakterisiert ist, fehlen Kenntnisse über den Prozess der Sortierung. Generell wird von beiden Prozessen angenommen, dass sie von verschiedenen, unabhängigen Mechanismen gesteuert werden. Diese Arbeit stellt einen neuen zellfreien Assay zur Untersuchung der Sortier- und Abschnürprozesse in frühen Endosomen vor. Dabei wird die Fähigkeit des Endosoms ausgenutzt, verschiedene Vesikelinhalte (Transferrin, Cholera Toxin Untereinheit B und LDL, low-density-lipoprotein) voneinander zu trennen. Diese Trennung benötigt sowohl die Bildung von Transportvesikeln, als auch die aktive Reifung von frühen Endosomen. Der Sortier- und Abschnürprozess wird durch Reagenzien gegen Clathrin, COPI, dynamin und Aktin nicht beeinträchtigt, während Antikörper gegen den Retromer Komplex den Prozess blockieren. Darüber hinaus benötigt der Prozess die endosomalen Proteine Rab5, Phosphatidylinositol-3-Phosphat und überraschenderweise auch den Dockingfaktor EEA1. Des Weiteren wird die Funktion des N-Ethylmaleimide-sensitiven Faktors (NSF), eines bekannten Fusions-Kofaktors, benötigt, während endosomale Fusion selbst nicht erforderlich ist. Daraus wird geschlussfolgert, dass Docking und Fusion, sowie Sortierung und Abschnürung von Vesikeln auf der molekularen Ebene stark miteinander verknüpft sind, obwohl sie gegenteilige Ziele verfolgen

SNARE Function Is Not Involved in Early Endosome Docking

Docking and fusion of transport vesicles constitute elementary steps in intracellular membrane traffic. While docking is thought to be initiated by Rab-effector complexes, fusion is mediated by SNARE (N-ethylmaleimide-sensitive factor [NSF] attachment receptor) proteins. However, it has been recently debated whether SNAREs also play a role in the establishment or maintenance of a stably docked state. To address this question, we have investigated the SNARE dependence of docking and fusion of early endosomes, one of the central sorting compartments in the endocytic pathway. A new, fluorescence-based in vitro assay was developed, which allowed us to investigate fusion and docking in parallel. Similar to homotypic fusion, docking of early endosomes is dependent on the presence of ATP and requires physiological temperatures. Unlike fusion, docking is insensitive to the perturbation of SNARE function by means of soluble SNARE motifs, SNARE-specific Fab fragments, or by a block of NSF activity. In contrast, as expected, docking is strongly reduced by interfering with the synthesis of phosphatidyl inositol (PI)-3 phosphate, with the function of Rab-GTPases, as well as with early endosomal autoantigen 1 (EEA1), an essential tethering factor. We conclude that docking of early endosomes is independent of SNARE function