Intracellular Trafficking of Guanylate-Binding Proteins Is Regulated by Heterodimerization in a Hierarchical Manner

Guanylate-binding proteins (GBPs) belong to the dynamin family of large GTPases and represent the major IFN-γ-induced proteins. Here we systematically investigated the mechanisms regulating the subcellular localization of GBPs. Three GBPs (GBP-1, GBP-2 and GBP-5) carry a C-terminal CaaX-prenylation signal, which is typical for small GTPases of the Ras family, and increases the membrane affinity of proteins. In this study, we demonstrated that GBP-1, GBP-2 and GBP-5 are prenylated in vivo and that prenylation is required for the membrane association of GBP-1, GBP-2 and GBP-5. Using co-immunoprecipitation, yeast-two-hybrid analysis and fluorescence complementation assays, we showed for the first time that GBPs are able to homodimerize in vivo and that the membrane association of GBPs is regulated by dimerization similarly to dynamin. Interestingly, GBPs could also heterodimerize. This resulted in hierarchical positioning effects on the intracellular localization of the proteins. Specifically, GBP-1 recruited GBP-5 and GBP-2 into its own cellular compartment and GBP-5 repositioned GBP-2. In addition, GBP-1, GBP-2 and GBP-5 were able to redirect non-prenylated GBPs to their compartment in a prenylation-dependent manner. Overall, these findings prove in vivo the ability of GBPs to dimerize, indicate that heterodimerization regulates sub-cellular localization of GBPs and underscore putative membrane-associated functions of this family of proteins

Investigation of STAT activation by cytotoxic necrotizing factors

Die Transkriptionsfaktoren STAT3 und STAT5 (Signal Transducer and Activator of Transcription) regulieren zahlreiche Gene, die die Entwicklung und Progression von Tumoren fördern. Ebenfalls treten bei verschiedenen Krebsarten Fehlfunktionen in der Regulation der kleinen GTPasen der Rho-Familie auf. Eine funktionelle Verknüpfung der beiden tumorassoziierten Proteine RhoA und STAT war allerdings bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurden die bakteriellen Toxine Cytotoxische-Nekrotisierende Faktoren (CNF) als direkte Aktivatoren der Rho-GTPasen eingesetzt, um diesen Signalweg aufzuklären. Die Toxine aktivieren Rho-GTPasen konstitutiv durch Deamidierung eines für die GTP-Hydrolyse essenziellen Glutaminrestes. In der vorliegenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass CNFY und CNF3 sechs bis acht Stunden nach Vergiftung eine Aktivierung von STAT3 induzieren. Als notwendig und ausreichend für die STAT-Aktivierung wurde RhoA, das gemeinsame Substrat der Toxine, identifiziert. Eine Intoxikation mit CNFY und CNF3 führt zu einer langfristigen Aktivierung von RhoA. Der Einsatz von CNF1 hingegen zeigt eine transiente Aktivierung, die nicht ausreichend für die Stimulation des STAT-Signalweges ist. Es wurde nachgewiesen, dass die Signalweiterleitung über ROCK, einem Effektorprotein von RhoA, vermittelt wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor AP1 durch CNFY und CNF3 abhängig von der Jun-Kinase (JNK) aktiviert wird und dieser Prozess im Signalweg oberhalb der Phosphorylierung von STAT3 stattfinden muss. Sowohl eine gesteigerte transkriptionelle Aktivität von AP1 als auch eine Phosphorylierung des AP1-Proteins ATF2 wurde detektiert. Weitere Versuche zeigten, dass die Expression und Sekretion von auto- oder parakrin wirkenden Faktoren für die STAT-Aktivierung notwendig sind. Durch eine systematische Analyse der CNF-induzierten Proteine gelang die Identifizierung des Chemokins CCL1 als relevanten Faktor für diese Signalvermittlung. Weiterhin belegen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Beteiligung des CCL1-Rezeptors CCR8 und eine Phosphorylierung an Tyr705 von STAT3 durch die Janus-Kinasen (JAKs). RhoA is reportedly involved in signal transducers and activators of transcription (STAT)-dependent transcription. However, the pathway connecting the GTPase and STAT signaling has not been characterized. Here, we made use of bacterial toxins, which directly activate Rho GTPases to analyze this pathway. Cytotoxic necrotizing factors (CNFs) are produced by pathogenic Escherichia coli strains and by Yersinia pseudotuberculosis. They activate small GTPases of the Rho family by deamidation of a glutamine, which is crucial for GTP hydrolysis. We show that RhoA activation leads to phosphorylation and activation of STAT3 and identify signal proteins involved in this pathway. RhoA-dependent STAT3 stimulation requires ROCK and Jun kinase activation as well as AP1-induced protein synthesis. The secretion of one or more factors activates the JAK-STAT pathway in an auto/paracrine manner. We identify CCL1/I-309 as an essential cytokine, which is produced and secreted upon RhoA activation and which is able to activate STAT3-dependent signaling pathways. <br