Untersuchungen zur Struktur und Funktion der UL11- und UL20-Proteine des equinen Herpesvirus Typ 1

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der UL11- und UL20-Homologe des equinen Herpesvirus Typ 1 (EHV-1). Dabei sollte vor allem auf deren Funktionen in späten Stadien des Replikationszyklus und auf ein mögliches Zusammenspiel eingegangen werden. Zunächst wurde das UL20-Protein identifiziert und sowohl strukturell als auch funktionell charakterisiert. Ein in Kaninchen hergestelltes Antiserum reagierte in Western Blot-Analysen spezifisch mit zwei Proteinen mit apparenten Molekulargewichten von 25 und 75 kDa, und trotz zweier Konsensussequenzen im offenen Leserahmen UL20 führte eine Hemmung der N-Glykosylierung des Proteins zu keiner Veränderung dieser Laufeigenschaften. Das Protein, das ab 6 h p.i. in Zellen nachweisbar war, wurde der Klasse der γ1-Proteine zugeordnet und als Bestandteil der Virushülle identifiziert. Eine Assoziation des UL20-Proteins mit zellulären Membranen zeigte sich nach Fraktionierung infizierter Zellen und nach Immunfluoreszenzfärbung UL20-exprimierender Zellen. UL20-Deletionsmutanten der EHV-1-Stämme RacL11 und RacH wurden über BAC-Mutagenese hergestellt. Die negativen Viren führten in Einschritt-Wachstumskinetiken zu bis zu 1000fach geringeren extrazellulären Titern als die entsprechenden Wildtyp-Viren. Die intrazelluläre Infektiosität war dagegen nur um das 3fache erniedrigt. Diese Ergebnisse wiesen auf eine Funktion von pUL20 beim späten "viral egress" hin. Eine Bedeutung des Proteins im "cell-to-cell-spread" wurde durch Untersuchung des Plaquephänotyps gezeigt. Während die Ausgangsviren und Revertanten zu deutlichen Plaques führten, bestanden die Plaques der Deletionsmutanten aus nur wenigen infizierten Zellen. Eine initiale Charakterisierung des UL11-Proteins von EHV-1 liegt bereits vor. Das Tegumentprotein, das eine Konsensussequenz für eine N-Myristylierung aufweist, assoziiert in infizierten Zellen mit Membranen und spielt eine Rolle im "viral egress" und vor allem im "cell-to-cell-spread". Zur genaueren Einordnung dieser Funktionen wurden die Auswirkungen der Deletion des Großteils der UL11-spezifischen Sequenzen auf die Replikation von EHV-1 in Zellkultur vor dem genetischen Hintergrund verschiedener EHV-1-Isolate (RacL22, RacL11), -Stämme (KyA) und -Mutanten (L11Δ49) untersucht. Sämtliche rekombinante Viren waren auf nicht komplementierenden Zelllinien vermehrungsfähig. Das UL11-Protein ist daher auch in Verbindung mit der Deletion der für die Glykoproteine E und I kodierenden Gene (KyA) bzw. der fehlenden Expression des UL49-Proteins für die Replikation von EHV-1 in Zellkultur als nicht essentiell anzusehen. Die Bestimmung eines Wachstumswertes der Deletionsmutanten und Ausgangsviren ergab jedoch Hinweise auf eine mögliche Interaktion von pUL11 mit den Glykoproteinen E und I bzw. dem Tegumentprotein pUL49. Die Funktion des UL11-Proteins im "cell-to-cell-spread" konnte durch Untersuchung des Plaquephänotyps, bei dem die UL11-deletierten Viren zu deutlich kleineren Plaques als die Ausgangsviren führten, bestätigt, jedoch nicht genauer definiert werden. Untersuchungen eines in seiner Myristylierungs-Sequenz mutierten UL11-Proteins ergaben weder eine Verschiebung der Laufeigenschaften im Western Blot, noch eine veränderte Verteilung in der transfizierten Zelle. Allerdings konnte eine Assoziation von pUL11 mit Lipid Rafts gezeigt werden. Diese muss über eine Modifikation des Proteins durch Myristylierung oder Palmitylierung vermittelt sein. Das UL20-Protein dagegen war nicht spezifisch in den Lipid Rafts angereichert. Von einem Zusammenspiel der beiden Proteine in diesen Membranbereichen in ihrer Funktion beim "cell-to-cell-spread" ist daher nicht auszugehen

Perturbation of Lytic and Latent Gammaherpesvirus Infection in the Absence of the Inhibitory Receptor CEACAM1

Control of gammaherpesvirus infections requires a complex, well orchestrated immune response regulated by positive and negative co-signaling molecules. While the impact of co-stimulatory molecules has been addressed in various studies, the role of co-inhibitory receptors has not been tested. The ITIM-bearing CEACAM1 is an inhibitory receptor expressed by a variety of immune cells, including B, T and NK cells. Using Ceacam1−/− mice, we analyzed the in vivo function of CEACAM1 during acute and latent murine gammaherpesvirus 68 (MHV-68) infection. During acute lytic replication, we observed lower virus titers in the lungs of Ceacam1−/− mice than in WT mice. In contrast, during latency amplification, Ceacam1−/− mice displayed increased splenomegaly and a higher latent viral load in the spleen. Analysis of the immune response revealed increased virus-specific antibody levels in Ceacam1−/− mice, while the magnitude of the T cell-mediated antiviral immune response was reduced. These findings suggest that inhibitory receptors can modulate the efficacy of immune responses against gammaherpesvirus infections

The Equine Herpesvirus 1 UL20 Product Interacts with Glycoprotein K and Promotes Egress of Mature Particles

The aim of the present study was to identify and functionally characterize the equine herpesvirus 1 (EHV-1) UL20 protein (UL20p). Using a specific antiserum, UL20p was shown to be associated with membranes of infected cells, as well as with envelopes of purified virions. By Western blot analysis, UL20p was detected in two main forms exhibiting M(r)s of 25,000 and 75,000. Both moieties did not enter the separating gel after heating of protein samples to 99°C. The slower-migrating form of UL20p contains N-linked carbohydrates, and its presence is dependent of that of other viral proteins. Infection of cells that either constitutively express UL20p or a gK-green fluorescent protein (GFP) fusion protein with various EHV-1 deletion mutants revealed a relatively stable hetero-oligomer containing gK and UL20p with an apparent M(r) of 75,000. As demonstrated by confocal microscopy, UL20p distribution in Rk13 cells changed from a diffuse granular or netlike appearance to a pattern confined to the Golgi network when gK was coexpressed. Analysis of a UL20 deletion mutant of EHV-1 strain RacL11 indicated an involvement of UL20p in cell-to-cell spread, as well as in very late events in virus egress. Based on these and electron microscopic studies we suggest that the EHV-1 UL20 protein might be necessary to avoid fusion of mature virions with membranes of their transport vesicles

Upregulation of CEACAM1 in lungs of infected WT mice.

<p>CEACAM1 expression was visualized in lung sections by staining with mAb CC1, followed by peroxidase-conjugated secondary antibody. CEACAM1 was neither expressed in uninfected <i>Ceacam1^−/−</i> mice (A, insert in A) nor in MHV-68-infected <i>Ceacam1^−/−</i> mice (B, insert in B). In uninfected WT mice, CEACAM1 was readily detectable on immune cells (solid arrows) and on alveolar cells but not or only marginally on bronchial epithelial cells (open arrows) (C). After MHV-68 infection, airway epithelial cells strongly upregulated CEACAM1 (D, arrows and insert in D). Bars, 200 µm (A-D), 50 µm (insert in A-D). a, aveolar cells; b, bronchial epithelial cells.</p

<i>Ceacam1^−/−</i> mice show stronger virus-specific antibody responses and exhibit lower IFN-γ but higher IL-5 serum levels in comparison to WT mice.

<p>A) Mice were infected i.n. with 5×10⁴ PFU of MHV-68. At days 17 and 42 after infection, blood was collected and serum was prepared and used in a virus neutralization assay. Data shown are means±SD compiled from two to four independent experiments. In each experiment, sera from 3 to 5 mice per group were pooled. Statistical analysis was performed using two-way ANOVA. The differences of the antibody levels were statistically significant between the two mouse strains, as indicated in the figure, as well as between the two time points. B) Mice were infected i.n. with 5×10⁴ PFU. At days 3, 6 and 8 after infection, cytokine levels in sera were determined by ELISA. Ratios were calculated on the basis of the raw data shown in C and D. Each symbol represents a single mouse. The horizontal bars indicate the means.</p

CEACAM1 expression on splenic B and T cells changes only marginally during infection.

<p>Mice were infected i.n. with 5×10⁴ PFU of MHV-68. At days 0, 6, 17 and 42 after infection, CEACAM1 expression by spleen cells was determined by three color flow cytometry. The indicated cells were labeled either with the CEACAM1-specific mAb CC1 (open curves) or an isotype-matched antibody (filled curves). A) Granulocytes from <i>Ceacam1^−/−</i> and WT mice were gated according to their characteristic forward/sideward scatter (verified by anti-GR1 (Ly6G) staining) and analysed for CEACAM1 expression. B) CEACAM1 expression on lymphocyte subpopulations from WT mice at different time points after infection. Cells were gated for expression of CD19 (B cells; left panel) and for expression of CD3 (T cells; right panel). The mean fluorescence intensity (mfi) is indicated by numbers (mfi isotype control/mfi specific staining). The experiment was repeated three times with similar results.</p

<i>Ceacam1^−/−</i> mice develop a significant weaker MHV-68-specific CD8⁺ T cell immune response during infection than WT mice.

<p>Mice were infected i.n. with 5×10⁴ PFU of MHV-68. Spleen cells (3×10⁶/mL) obtained on days 17 and 42 p.i. were restimulated with MHV-68 ORF6- and ORF61-deduced peptides prior to intracellular staining for IFN-γ. Double-positive (CD8⁺ IFN-γ⁺) cells were peptide-specific T cells. A) Dotplots of a representative experiment (ORF6 at day 17) with controls (without addition of peptides or after stimulation with anti-CD3 mAb). The mean numbers of double-positive CD8⁺ IFN-γ⁺ T cells per 10⁵ CD8⁺ spleen cells±SD of three individual mice (upper panel) and the mean number of double-positive CD8⁺ IFN-γ⁺ T cells per spleen±SD of three individual mice (lower panel) are shown. The p values for the differences between <i>Ceacam1^−/−</i> and WT mice are indicated.</p