Plasmonics for advance single-molecule fluorescence spectroscopy and imaging in biology

The elucidation of complex biological processes often requires monitoring the dynamics and spatial organization of multiple distinct proteins organized on the sub-micron scale. This length scale is well below the diffraction limit of light, and as such not accessible by classical optical techniques. Further, the high molecular concentrations found in living cells, typically in the micro- to mili-molar range, preclude single-molecule detection in confocal volumes, essential to quantify affinity constants and protein-protein reaction rates in their physiological environment. To push the boundaries of the current state of the art in single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy, plasmonic materials offer encouraging perspectives. From thin metallic films to complex nano-antenna structures, the near-field electromagnetic coupling between the electronic transitions of single emitters and plasmon resonances can be exploited to expand the toolbox of single-molecule based fluorescence imaging and spectroscopy approaches. Here, we review two of the most current and promising approaches to study biological processes with unattainable level of detail. On one side, we discuss how the reduction of the fluorescence lifetime of a molecule as it approaches a thin metallic film can be exploited to decode axial information with nanoscale precision. On the other, we review how the tremendous progress on the design of plasmonic antennas that can amplify and confine optical fields at the nanoscale, powered a revolution in fluorescence correlation spectroscopy. Besides method development, we also focus in describing the most interesting biological application of both technologies

Quantitative single molecule analysis of podoplanin clustering in fibroblastic reticular cells uncovers CD44 function

Upon initial immune challenge, dendritic cells (DCs) migrate to lymph nodes and interact with fibroblastic reticular cells (FRCs) via C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2). CLEC-2 binds to the membrane glycoprotein podoplanin (PDPN) on FRCs, inhibiting actomyosin contractility through the FRC network and permitting lymph node expansion. The hyaluronic acid receptor CD44 is known to be required for FRCs to respond to DCs but the mechanism of action is not fully elucidated. Here, we use DNA-PAINT, a quantitative single molecule super-resolution technique, to visualize and quantify how PDPN clustering is regulated in the plasma membrane of FRCs. Our results indicate that CLEC-2 interaction leads to the formation of large PDPN clusters (i.e. more than 12 proteins per cluster) in a CD44-dependent manner. These results suggest that CD44 expression is required to stabilize large pools of PDPN at the membrane of FRCs upon CLEC-2 interaction, revealing the molecular mechanism through which CD44 facilitates cellular crosstalk between FRCs and DCs

Exploration of the metallic nanoparticles-photochemically active molecules interactions

En esta Tesis se estudian los efectos de las propiedades plasmónicas de nanopartículas (NPs) metálicas con estados electrónicamente excitados y metaestables de moléculas próximasa su superficie. El objetivo es la determinación cuantitativa de la magnitud del realce de laemisión, del efecto de protección fotoquímica, de la intensificación de la sección eficaz deabsorción de dos fotones y de la influencia de la superficie en la velocidad de isomerización. Con tal fin, se sintetizaron nanoestructuras acopladas a las sondas de interés. Los sistemas seestudiaron por espectroscopía y microscopía de fluorescencia a nivel de ensamble y demoléculas únicas como así también por absorción diferencial resuelta en el tiempo. El realce del brillo molecular a nivel de ensamble para sondas xanténicas de diferenteeficiencia cuántica de emisión de fluorescencia ubicadas en la vecindad de NPs esféricas denúcleo de oro – cáscara de sílica se evaluó por medida de la ganancia en la emisión porespectroscopía y microscopía de fluorescencia en sistemas con diferente espesor de la capa desílica. Se verificó experimentalmente que las sondas más débilmente fluorescentes son las másintensificadas. Por otra parte, los sistemas constituidos por AuNPs y la sonda fotocrómicaespiropirano – merocianina, se estudiaron a nivel de molécula única – partícula única. Conmicroscopía de fluorescencia de campo amplio se registraron las trazas temporales demoléculas individuales de merocianina, encendidas en forma espontánea por isomerizacióndesde el espiropirano, con alta resolución óptica en su localización respecto de la posición delas AuNPs sobre la que se encendieron. El análisis estadístico de estas trazas permitiócuantificar el brillo molecular, tiempo de encendido y número total de fotones emitidos por lasonda en función de la distancia a la AuNP y hacer un mapa de la interacción. Se demuestra así,en un simple experimento, que la interacción plasmónica permite a la vez un realce del brillo,pero más aún un incremento de hasta 100 veces en el tiempo de monitoreo y en el número defotones emitidos antes del fotoblanqueo, ampliando las posibilidades de las experiencias consúper resolución óptica y encendido secuencial de las sondas. Las NPs metálicas pueden originar señales ópticas no-lineales en moléculas ubicadasen su vecindad. En otro conjunto de experimentos, se analizó la intensificación de la seccióneficaz de absorción de dos fotones de un compuesto fotocrómico que presenta propiedadesfluorescentes en su isómero metaestable. La activación de un aducto fotocrómico –fluorescente formado por un cromeno y una cumarina fue posible por excitación plasmónicade nanoplacas triangulares de plata sobre las que se depositó una película polimérica delgadaen la que se embebió la sonda. Se obtuvieron secuencias temporales de imágenes enmicroscopía de campo evanescente, lo que permitió contar los eventos de activación demoléculas individuales. Se encontró una dependencia cuadrática entre este número de eventosy la intensidad de irradiación. Este experimento demuestra que la activación fotocrómicaasistida por el plasmón de la NP bajo irradiación con luz visible, permite realizar experimentosde microscopía de súper resolución usando un sólo láser. Finalmente, se estudió la cinética de isomerización térmica de cis a trans, en unafamilia de azobencenos sustituidos en la posición para en uno ó ambos anillos, en presencia de AuNPs. La dinámica se analizó con un esquema cinético microheterogéneo en suspensiones de AuNPs en solución de la sonda. El decaimiento térmico del isómero cis siguió una cinética deprimer orden con AuNPs y un comportamiento sigmoideo con AuNPs con cáscara de sílica. Sedeterminaron incrementos de hasta cuatro órdenes de magnitud en la constante de velocidadde isomerización sobre la superficie de oro. La acción catalítica de estas nanoestructuras serelaciona con el debilitamiento del doble enlace del grupo azo para el isómero cis sobre lasuperficie del oro. En estas experiencias, se consideraron los efectos de sustituyentes, delsolvente, y de la acidez del medio. Sobre las nanoestructuras esféricas oro – sílica, fue posibledeterminar la naturaleza superficial de la catálisis de isomerización y obtener valores para laconstante de difusión de los azobencenos en sílica. Los aportes de esta Tesis presentan relevancia no sólo en el estudio básico de lasdiferentes interacciones sonda – NPs, si no también, en el diseño óptimo de sensores que sebasan en híbridos de sondas fotocrómicas y/ó fluorescente con NPs metálicas. Estos permitenaumentar a la vez el límite de detección temporal y espacial en microscopías ópticas, así comola modulación temporal de una señal fotocrómica.This Thesis studies the effects of the plasmonic properties of metallic nanoparticles (NPs) with electronically excited and metastable states of molecules close to their surface. Thegoal is the quantitative determination of the magnitude of the emission enhancement, of theeffect of photodamage protection, of the two-photon absorption cross-section intensification,and of the influence of the surface on isomerization reaction rates. To this end, nanostructurescoupled to dyes of interest were synthesized. The systems were studied by fluorescencespectroscopy and microscopy at the ensemble and single molecule level as well as by timeresolved differential absorption. The molecular brightness enhancement in xanthenic probes with different emissionquantum yield located in the vicinity of spherical gold core – silica shell NPs was evaluated atthe ensemble level by measuring the gain in the fluorescence emission with fluorescencespectroscopy and microscopy for systems with different silica layer thickness. It wasexperimentally verified that the most weakly fluorescent probes are the most intensified. On the other side, AuNPs and photochromic spiropyran - merocyanine systems werestudied at the single molecule - single particle level. Temporal traces of merocyanine individualmolecules, which had turned on spontaneously by spiropyran isomerization, were recordedwith wide-field fluorescence microscopy, and processed for high-resolution optical localizationof them relative to the position of the AuNP over which they turned on. Statistical analysis ofthese single molecule time traces allowed to quantify the molecular brightness, the ON time,and the total number of emitted photons by the probe as a function of the dye-AuNP distanceand to map the interaction. This approach shows with a simple experiment that the plasmonicinteraction can achieve not only brightness enhancement but also a 100 fold increase in themonitoring time and in the number of emitted photons before photobleaching, expanding thepossibilities of high performance optical microscopy and of the sequential turn on of theprobes. Metallic NPs can cause non-linear optical signals in molecules located in theirneighborhood. In another set of experiments, the amplification of the two-photon absorptioncross section of a photochromic compound with fluorescent properties in its metastable isomerwas analyzed. The activation of the chromene-coumarin photochromic-fluorescent probe waspossible by plasmon excitation of triangular silver nanoplates over which a thin polymer filmembedded with the dye was deposited. The number of events of activated individual moleculeswas counted using the temporal image sequences obtained with an evanescent fieldmicroscope. Quadratic dependence for the number of events as a function of the irradiationintensity was observed. This experiment demonstrates that plasmon assisted photochromicactivation under visible light irradiation enables super resolution microscopy experimentsusing a single laser. Finally, the kinetics of the thermal cis - trans isomerization in a family of azobenzenes,substituted in the para position in one or both of the rings, in the presence of AuNPs wasstudied by using a microheterogeneous kinetic scheme for AuNPs suspended in the probesolution. The thermal decay of the cis isomer followed first order kinetics in the presence of AuNPs and a sigmoid behavior for AuNPs with silica shells. Accelerations of up to four ordersof magnitude were determined for the isomerization rate constant over the gold surface. Thecatalytic action of these nanostructures is related to the weakening of the double bond in theazo group of the cis isomer over the gold surface. These experiments contemplate thesubstituent effect, the solvent, and the acidity of the medium. The spherical gold - silicananostructures allowed to determine the surface nature of the isomerization catalysis,obtaining values for the diffusion constant of azobenzenes in silica. The contributions arising from this Thesis have relevance not only in the fundamentalstudy of the different probe - NPs interactions, but also, in the optimal design of sensors basedon hybrid photochromic and/or fluorescent probes with metal NPs, that allows for the increasein temporal and spatial detection limits in optical microscopy and for the temporal modulationof a photochromic signal.Fil: Simoncelli, Sabrina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Exploration of the metallic nanoparticles-photochemically active molecules interactions

En esta Tesis se estudian los efectos de las propiedades plasmónicas de nanopartículas (NPs) metálicas con estados electrónicamente excitados y metaestables de moléculas próximasa su superficie. El objetivo es la determinación cuantitativa de la magnitud del realce de laemisión, del efecto de protección fotoquímica, de la intensificación de la sección eficaz deabsorción de dos fotones y de la influencia de la superficie en la velocidad de isomerización. Con tal fin, se sintetizaron nanoestructuras acopladas a las sondas de interés. Los sistemas seestudiaron por espectroscopía y microscopía de fluorescencia a nivel de ensamble y demoléculas únicas como así también por absorción diferencial resuelta en el tiempo. El realce del brillo molecular a nivel de ensamble para sondas xanténicas de diferenteeficiencia cuántica de emisión de fluorescencia ubicadas en la vecindad de NPs esféricas denúcleo de oro – cáscara de sílica se evaluó por medida de la ganancia en la emisión porespectroscopía y microscopía de fluorescencia en sistemas con diferente espesor de la capa desílica. Se verificó experimentalmente que las sondas más débilmente fluorescentes son las másintensificadas. Por otra parte, los sistemas constituidos por AuNPs y la sonda fotocrómicaespiropirano – merocianina, se estudiaron a nivel de molécula única – partícula única. Conmicroscopía de fluorescencia de campo amplio se registraron las trazas temporales demoléculas individuales de merocianina, encendidas en forma espontánea por isomerizacióndesde el espiropirano, con alta resolución óptica en su localización respecto de la posición delas AuNPs sobre la que se encendieron. El análisis estadístico de estas trazas permitiócuantificar el brillo molecular, tiempo de encendido y número total de fotones emitidos por lasonda en función de la distancia a la AuNP y hacer un mapa de la interacción. Se demuestra así,en un simple experimento, que la interacción plasmónica permite a la vez un realce del brillo,pero más aún un incremento de hasta 100 veces en el tiempo de monitoreo y en el número defotones emitidos antes del fotoblanqueo, ampliando las posibilidades de las experiencias consúper resolución óptica y encendido secuencial de las sondas. Las NPs metálicas pueden originar señales ópticas no-lineales en moléculas ubicadasen su vecindad. En otro conjunto de experimentos, se analizó la intensificación de la seccióneficaz de absorción de dos fotones de un compuesto fotocrómico que presenta propiedadesfluorescentes en su isómero metaestable. La activación de un aducto fotocrómico –fluorescente formado por un cromeno y una cumarina fue posible por excitación plasmónicade nanoplacas triangulares de plata sobre las que se depositó una película polimérica delgadaen la que se embebió la sonda. Se obtuvieron secuencias temporales de imágenes enmicroscopía de campo evanescente, lo que permitió contar los eventos de activación demoléculas individuales. Se encontró una dependencia cuadrática entre este número de eventosy la intensidad de irradiación. Este experimento demuestra que la activación fotocrómicaasistida por el plasmón de la NP bajo irradiación con luz visible, permite realizar experimentosde microscopía de súper resolución usando un sólo láser. Finalmente, se estudió la cinética de isomerización térmica de cis a trans, en unafamilia de azobencenos sustituidos en la posición para en uno ó ambos anillos, en presencia de AuNPs. La dinámica se analizó con un esquema cinético microheterogéneo en suspensiones de AuNPs en solución de la sonda. El decaimiento térmico del isómero cis siguió una cinética deprimer orden con AuNPs y un comportamiento sigmoideo con AuNPs con cáscara de sílica. Sedeterminaron incrementos de hasta cuatro órdenes de magnitud en la constante de velocidadde isomerización sobre la superficie de oro. La acción catalítica de estas nanoestructuras serelaciona con el debilitamiento del doble enlace del grupo azo para el isómero cis sobre lasuperficie del oro. En estas experiencias, se consideraron los efectos de sustituyentes, delsolvente, y de la acidez del medio. Sobre las nanoestructuras esféricas oro – sílica, fue posibledeterminar la naturaleza superficial de la catálisis de isomerización y obtener valores para laconstante de difusión de los azobencenos en sílica. Los aportes de esta Tesis presentan relevancia no sólo en el estudio básico de lasdiferentes interacciones sonda – NPs, si no también, en el diseño óptimo de sensores que sebasan en híbridos de sondas fotocrómicas y/ó fluorescente con NPs metálicas. Estos permitenaumentar a la vez el límite de detección temporal y espacial en microscopías ópticas, así comola modulación temporal de una señal fotocrómica.This Thesis studies the effects of the plasmonic properties of metallic nanoparticles (NPs) with electronically excited and metastable states of molecules close to their surface. Thegoal is the quantitative determination of the magnitude of the emission enhancement, of theeffect of photodamage protection, of the two-photon absorption cross-section intensification,and of the influence of the surface on isomerization reaction rates. To this end, nanostructurescoupled to dyes of interest were synthesized. The systems were studied by fluorescencespectroscopy and microscopy at the ensemble and single molecule level as well as by timeresolved differential absorption. The molecular brightness enhancement in xanthenic probes with different emissionquantum yield located in the vicinity of spherical gold core – silica shell NPs was evaluated atthe ensemble level by measuring the gain in the fluorescence emission with fluorescencespectroscopy and microscopy for systems with different silica layer thickness. It wasexperimentally verified that the most weakly fluorescent probes are the most intensified. On the other side, AuNPs and photochromic spiropyran - merocyanine systems werestudied at the single molecule - single particle level. Temporal traces of merocyanine individualmolecules, which had turned on spontaneously by spiropyran isomerization, were recordedwith wide-field fluorescence microscopy, and processed for high-resolution optical localizationof them relative to the position of the AuNP over which they turned on. Statistical analysis ofthese single molecule time traces allowed to quantify the molecular brightness, the ON time,and the total number of emitted photons by the probe as a function of the dye-AuNP distanceand to map the interaction. This approach shows with a simple experiment that the plasmonicinteraction can achieve not only brightness enhancement but also a 100 fold increase in themonitoring time and in the number of emitted photons before photobleaching, expanding thepossibilities of high performance optical microscopy and of the sequential turn on of theprobes. Metallic NPs can cause non-linear optical signals in molecules located in theirneighborhood. In another set of experiments, the amplification of the two-photon absorptioncross section of a photochromic compound with fluorescent properties in its metastable isomerwas analyzed. The activation of the chromene-coumarin photochromic-fluorescent probe waspossible by plasmon excitation of triangular silver nanoplates over which a thin polymer filmembedded with the dye was deposited. The number of events of activated individual moleculeswas counted using the temporal image sequences obtained with an evanescent fieldmicroscope. Quadratic dependence for the number of events as a function of the irradiationintensity was observed. This experiment demonstrates that plasmon assisted photochromicactivation under visible light irradiation enables super resolution microscopy experimentsusing a single laser. Finally, the kinetics of the thermal cis - trans isomerization in a family of azobenzenes,substituted in the para position in one or both of the rings, in the presence of AuNPs wasstudied by using a microheterogeneous kinetic scheme for AuNPs suspended in the probesolution. The thermal decay of the cis isomer followed first order kinetics in the presence of AuNPs and a sigmoid behavior for AuNPs with silica shells. Accelerations of up to four ordersof magnitude were determined for the isomerization rate constant over the gold surface. Thecatalytic action of these nanostructures is related to the weakening of the double bond in theazo group of the cis isomer over the gold surface. These experiments contemplate thesubstituent effect, the solvent, and the acidity of the medium. The spherical gold - silicananostructures allowed to determine the surface nature of the isomerization catalysis,obtaining values for the diffusion constant of azobenzenes in silica. The contributions arising from this Thesis have relevance not only in the fundamentalstudy of the different probe - NPs interactions, but also, in the optimal design of sensors basedon hybrid photochromic and/or fluorescent probes with metal NPs, that allows for the increasein temporal and spatial detection limits in optical microscopy and for the temporal modulationof a photochromic signal.Fil: Simoncelli, Sabrina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Mechanistic insight into the Z-E isomerization catalysis of azobenzenes mediated by bare and core-shell gold nanoparticles

We explored the catalytic effect of 15 nm diameter gold nanoparticles (AuNPs) upon the thermal Z–E isomerization reaction of azobenzene and nine 4 and 4-4′ substituted azobenzenes (ABs). The kinetics follows a first order rate in ranges of [ABs] = 5 to 50 μM and [AuNPs] = 50 pM to 1 nM. A kinetic analysis of this compartmentalized system renders the thermal Z–E isomerization rate constant associated with each AuNP. Enhancements of 10- to 106-fold were measured for this rate constant in comparison to the same free ABs in solution. Experiments with selective Au facet coverage, as well as the kinetics studied in gold–silica core–shell nanoparticles (AuNP@SiO2) of different thicknesses, demonstrate the surface nature of the catalysis and allow one to evaluate the diffusion coefficient of azobenzene in the silica layer.Fil: Simoncelli, Sabrina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía; ArgentinaFil: Aramendia, Pedro Francisco. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; Argentina. Universidad de Buenos Aires; Argentin

Chiral power change upon photoisomerization in twisted nematic liquid crystals

In this work, we use the photoisomerization of azobenzenes, a phenanthrospirooxazine, and a fulgide in a twisted nematic liquid crystalline phase to change the chiral twisting power of the system. The changes are probed by the rotatory power of linearly polarized light. Time resolved and steady state experiments are carried out. The chiral change and the photoisomerization process have similar characteristic recovery times and activation energy, thus probing that the change is induced by the modification in the chemical composition of the photochromic dopant system. The amplitude of the light twisting power change correlates with the order change in the liquid crystal (LC) but not with the modification in the absorption characteristics of the system. This indicates that the driving force of the chiral change is the microscopic order modification in the LC phase that affects the helical pitch of the phase.Fil: Simoncelli, Sabrina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía; ArgentinaFil: Aramendia, Pedro Francisco. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Centro de Investigaciones en Bionanociencias "Elizabeth Jares Erijman"; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía; Argentin

Photochemical reaction mechanisms and kinetics with molecular nanocrystals: surface quenching of triplet benzophenone nanocrystals

Organic molecular nanocrystals suspended in water are useful when studying reactions that occur in the solid state because they retain not only the reactive and supramolecular properties of bulk crystals, but are also amenable to transmission spectroscopy. Having previously studied the triplet state of benzophenone nanocrystals by laser flash photolysis transmission spectroscopy, we now report nanosecond experiments in the presence of several possible quenchers: anionic and cationic surfactants, dissolved oxygen, and as a function of solvent deuteration (H2O and D2O). After finding these to have no effect, several anionic quenchers (IS, BrS, and NS3) were tested by Stern-Volmer analysis. Significant correlation between the quenching rates in solution and in nanocrystals suggests that the electronic excitation is accessible to quenchers at the surface. © 2010 John Wiley & Sons, Ltd.Fil: Simoncelli, Sabrina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. University of California at Los Angeles; Estados Unidos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física; ArgentinaFil: Kuzmanich, Gregory. University of California at Los Angeles; Estados UnidosFil: Gard, Matthew N.. University of California at Los Angeles; Estados UnidosFil: Garcia Garibay, Miguel A.. University of California at Los Angeles; Estados Unido

Proton transfer from 2-naphthol to aliphatic amines in supercritical CO 2

The proton transfer from 2-naphthol to aliphatic amines was studied in supercritical CO 2 (scCO 2) and in cyclohexane as reference solvent, by absorption and fluorescence spectroscopy and by time-resolved emission. Irradiation of 2-naphthol in scCO 2 in the presence of ethyldiisopropylamine shows dynamic fluorescence quenching of the acidic form of 2-naphthol and emission from the basic form. Fluorescence excitation spectra show that the emission of the basic form is originated upon excitation of the acidic form. The interaction between 2-naphthol and the amines is described by the formation of a complex with proton donor - acceptor character in the ground and excited states of 2-naphthol. The acidity increase of 2-naphthol upon electronic excitation to the first excited singlet in scCO 2 is as high as in water. Proton transfer quantum yields of 0.6 can be easily achieved in scCO 2. The results have implications for carrying out acid - base catalyzed reactions in scCO 2. (Figure presented) © 2011 American Chemical Society.Fil: Simoncelli, Sabrina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física; ArgentinaFil: Hoijemberg, Pablo Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física; ArgentinaFil: Japas, María Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Comisión Nacional de Energía Atómica; Argentina. Universidad Nacional de San Martín; ArgentinaFil: Aramendia, Pedro Francisco. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física; Argentin

Determination of association equilibrium constant from single molecule fluorescence localization microscopy

Single molecule fluorescence localization microscopy provides molecular localization with a precision in the tens of nanometer range in the plane perpendicular to the light propagation. This opens the possibility to count molecules and correlate their locations, starting from a map of the actual positions in a single molecule super resolution image. Considering molecular pair correlation as an indication of interaction, and a way to discern them from free molecules, we describe a method to calculate thermodynamic equilibrium constants. In this work, we use as a test system two complementary homo-oligonucleotides, one strand marked with Cyanine 3.5 and the other with Alexa Fluor 647. Hybridization is controlled by the amount of each strand, temperature, and the ionic force, and measured in steady state emission. The same samples are examined in Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) experiments with split-field simultaneous two-colour detection. The effect of multiblinking, labelling-detection efficiency, and determination of the critical distance for association are discussed. We consistently determine values in STORM coincident with those of the bulk experiment