Real time PCR in the detection and quantification of PCV2 in different organs of clinically healthy and presenting PMWS pigs

O Porcine circovirus 2 (PCV2) é um vírus não envelopado com genoma de DNA circular fita simples de aproximadamente 1,76 Kb. O PCV2 é o principal agente etiológico das doenças associadas ao PCV2 (PCVAD), sendo o responsável por grandes perdas econômicas na indústria de suínos. Os objetivos deste trabalho consistiram da utilização de metodologias moleculares para a determinação dos órgãos mais adequados para a quantificação da carga viral do PCV2 e a comparação dos genótipos e carga viral em órgãos com diferentes estágios de lesões teciduais. O DNA foi extraído com o kit Wizard SV Genomic Purification System (Promega). As reações de nested PCR foram realizadas utilizando dois pares de oligonucleotídeos e analisadas em gel de agarose. A PCR em tempo real foi realizada utilizando o método TaqMan. As amostras de tecidos foram fixadas em formol 10%, incluídas em blocos de parafina e processadas para a investigação histopatológica. A comparação da sensibilidade do método da PCR em tempo real com a nested PCR mostrou 91% de amostras positivas pelo método da PCR em tempo real, enquanto a nested PCR foi capaz de detectar apenas 66,5% de amostras positivas. Estes resultados mostram que a PCR em tempo real é mais eficaz para detectar o PCV2 em amostras de tecidos do que a nested PCR. Para as amostras de suínos analisadas, os linfonodos foram os que apresentaram a carga viral média significativamente superior aos demais tipos de órgãos (P<0,01) sendo, portanto, o órgão recomendado para ser utilizado em estudos de diagnóstico e patogenia do PCV2. As comparações entre a carga viral e os quatro graus de lesões não mostraram nenhum resultado significativo, assim acredita-se que os diferentes graus de lesões linfóides podem estar associados a outros co-fatores infecciosos ou não infecciosos.Porcine circovirus 2 (PCV2) is a non-enveloped virus containing a single stranded circular DNA of approximately 1.76 Kb. PCV2 is the primary etiologic agent of porcine circovirus-associated disease (PCVAD) responsible for large economic losses in the swine industry. The objectives of this work were to use molecular methods to determine the most suitable organs for quantification of PCV2 viral load and compare the genotype and viral load in organs with different levels of tissue injury. A plasmid containing the complete viral genome was quantified by spectrophotometry and used to create a standard curve for PCV2 quantification. DNA was extracted using the Wizard SV Genomic Purification System (Promega). Reactions of nested PCR were performed using two pairs of primers and analyzed in agarose gel. Real-time PCR was carried out using TaqMan. Tissue samples were fixed in 10% formalin, embedded in paraffin blocks and processed for histopathological investigation. Comparison of sensitivity of real time PCR with nested PCR showed 91% of positive samples by real time PCR, whereas nested PCR detected only 66.5% of positive samples. Results showed that real time PCR is more effective to detect PCV2 in tissue samples than nested PCR. In the tested swine samples, lymph nodes showed mean viral load significantly higher than other types of organs (P <0.01) and thus it is recommended for PCV2 diagnosis and pathogenesis studies. Comparisons among viral load and the four injury levels did not show any significant results, it is believed, therefore, that the different levels of lymphoid lesions may be associated with other infectious or non-infectious co-factors.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic

Analysis of genetic diversity and molecular evolution of Infectious bursal disease virus (IBDV)

O Infectious bursal disease virus (IBDV) é considerado um dos patógenos mais importantes da indústria avícola. Considerando as diferenças nos níveis de virulência entre os isolados de IBDV, este trabalho propõe uma definição de genotipagem não arbitrária e uma nomenclatura unificada para os isolados virais de IBDV. Nesta abordagem, 96 sequências completas da VP2 e 561 sequências correspondentes a região hipervariável da VP2 (hvVP2) disponíveis no GenBank foram analisadas e agrupadas por quatro diferentes métodos (UPGMA, Neighbor-joining, Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana). O valor limite de 0,032 foi selecionado para agrupar os isolados de IBDV em três genótipos: IBDV-1, IBDV-2 e IBDV-3. Além disso, um quarto genótipo contendo sequências de hvVP2 não agrupadas foi definido como IBDV-4. Logo, foi possível estabelecer uma definição de genótipos para o IBDV e fornecer critérios claros para a classificação do IBDV abaixo do nível de gênero. As sequências da hvVP2 são marcadores filogenéticos confiáveis para a genotipagem do IBDV, uma vez que foram capazes de reconstruir a mesma árvore das sequências completas da VP2. Neste trabalho, a epidemiologia dos isolados brasileiros do IBDV foi também analisada em um contexto evolutivo. Inicialmente, as forças seletivas que atuaram durante a diversificação do isolados virais do IBDV foram testadas. Em seguida, hipóteses filogenéticas foram calculadas por Inferência Bayesiana e abordagens filogeográficas foram utilizadas para a predição da dispersão do IBDV. Seis sequências completas da VP1 (RNA polimerase dependente de RNA) e 26 sequências completas da VP2 (proteína capsidial externa) foram produzidas nesse estudo. Os resultados demonstraram que a seleção negativa é a principal força evolutiva que afeta a diversidade de nucleotídeos e as taxas de evolução do IBDV. A partir da análise filogeográfica da VP2 foi possível sugerir que os isolados de IBDV foram introduzidos no Brasil, por pelo menos, três eventos de introdução viral.Infectious bursal disease virus (IBDV) is considered one of the most important pathogens for chickens of the poultry industry. Considering the differences in levels of virulence among isolates of IBDV, this paper proposes a non-arbitrary genotyping definition and a unified nomenclature for the viral isolates of IBDV. In this approach, the sets of 96 VP2 and 561 hvVP2 sequences available in GenBank are analyzed and clustered by four different methods (UPGMA, Neighbor-joining, Maximum Likelihood and Bayesian inference). A threshold value of 0.032 of pairwise distance was selected to group the IBDV isolates in three genotypes: IBDV-1, IBDV-2, and IBDV-3. In addition, the fourth group containing unclassified hvVP2 sequences was defined as genotype IBDV-4. The present work contributes to the establishment of a genotype definition for IBDV and provides clear criteria for IBDV classification below the genus level. The hvVP2 sequences are a reliable phylogenetic marker for IBDV genotypes since it were able to reconstruct the same tree as the whole VP2 sequences. In this work, an evolutionary epidemiology of viral isolates of IBDV was assessed. First, the selective forces that operated during the diversification of IBDV were tested. Then, Bayesian Markov chain Monte Carlo (MCMC) coalescent analyses and phylogeographical approaches were selected to predict IBDV dispersion. Six VP1 (RNA-dependent RNA polymerase) complete sequences and 26 VP2 (outer capsid protein) complete sequences were produced in this study. The results showed that negative selection is the main evolutionary force that affects nucleotide diversity and rates of evolution of IBDV. In addition, phylogeographic analysis of VP2 suggests that IBDV isolates were introduced in Brazil by at least three events of viral introduction.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic

The paradox of feline cCoronavirus pathogenesis: a review

Feline coronavirus (FCoV) is an enveloped single-stranded RNA virus, of the family Coronaviridae and the order Nidovirales. FCoV is an important pathogen of wild and domestic cats and can cause a mild or apparently symptomless enteric infection, especially in kittens. FCoV is also associated with a lethal, systemic disease known as feline infectious peritonitis (FIP). Although the precise cause of FIP pathogenesis remains unclear, some hypotheses have been suggested. In this review we present results from different FCoV studies and attempt to elucidate existing theories on the pathogenesis of FCoV infection

Retrospective study on Porcine circovirus-2 by nested pcr and real time pcr in archived tissues from 1978 in Brazil

Porcine circovirus-2 (PCV-2) infection is currently considered an important disease of swine. The pathogenic agent was first described in Brazil in 2000. This study detected the PCV-2 DNA in four Brazilian pig tissues collected between 1978 and 1979. This observation is the oldest description of this virus in Brazil