Molecular and mutational analysis of a wheat thaumatin-like xylanase inhibitor (TLXI)

Endo-β-1,4-xylanasen (xylanasen, EC 3.2.1.8.) zijn sleutelenzymen in de degradatie van heteroxylan, het belangrijkste hemicellulose in de celwand van planten. Microbiële xylanolytische enzymen hebben gedurende de laatste tien jaar de aandacht getrokken omwille van hun biotechnologisch potentieel in vele industriële processen. Omwille van hun hydrolytische activiteit op heteroxylan hebben ze immers een grote impact op de functionaliteit van deze polysachariden in verschillende graanverwerkendende industriële processen. Omdat ze bovendien in staat zijn om de plantencelwand te degraderen, hebben xylanasen, vooral van fungale oorsprong, een mogelijke rol in de fytopathogenese. Ze hebben daarenboven ook potentieel in de productie van xylooligosachariden. De aanwezigheid in graangewassen van proteïnen met xylanase inhiberende capaciteit werd voor het eerst vastgesteld door het Laboratorium voor Levensmiddelenchemie van de K.U.Leuven in 1997 (Debyser et al., 1997). Wat later slaagde men erin om een eerste type xylanase inhibitoren op te zuiveren uit tarwe (Triticum aestivum). Deze werden, verwijzend naar hun oorsprong, TAXI’s genoemd. In 1999 werd een tweede klasse xylanase inhiberende eiwitten geïdentificeerd die XIPs werden genoemd. Bij de start van deze studie werd een nieuw type xylanase inhibitor opgezuiverd uit tarwe. Op basis van zijn sequentiehomologie met thaumatine-achtige eiwitten (TLPs), eiwitten die ingedeeld worden bij groep 5 van de pathogenesis-gerelateerde eiwitten, werd deze nieuwe inhibitor TLXI, thaumatin-like xylanase inhibitor, genoemd. Omdat er tot nu toe geen andere TLPs gekend zijn die xylanase inhiberende activiteit bezitten, vertegenwoordigt TLXI een nieuwe functie binnen deze groep van proteïnen. De moleculaire identificatie, recombinante expressie en daaropvolgende biochemische karakterisering en mutagenese van TLXI vormen het onderwerp van deze thesis die opgedeeld is in twee delen. De introductie vormt het eerste deel en verschaft een achtergrond die iemand in staat stelt om het kader van deze studie te begrijpen. In een tweede deel worden de resultaten van dit werk uiteengezet. Hoofdstuk één schetst de context van dit werk door de drie belangrijke spelers voor te stellen: de substraten (xylanen), de enzymen (xylanasen) en de inhibitoren. Aangezien heteroxylanen een heterogene groep polysachariden vormen, vereist hun volledige afbraak de inwerking van verschillende enzymen, waarvan de xylanasen in detail worden besproken. Hun klassificatiesysteem wordt toegelicht en de klemtoon wordt gelegd op xylanasen van familie 10 en 11. Bovendien wordt een overzicht gegeven van de belangrijkste industriële toepassingen van xylanasen van microbiële oorsprong. Omdat TLXI een nieuw lid is van de groep van de xylanase inhibitoren wordt de huidige stand van zaken omtrent de reeds beschreven xylanase inhibitoren (TAXI en XIP) gegeven. Waar TLXI aan de ene kant functioneel verwant is met de xylanase inhibitoren, is hij op sequentieniveau verwant met de TLPs die worden besproken in hoofdstuk twee. De gemeenschappelijke factor binnen deze groep eiwitten is dat ze allen sequentiesimilariteit vertonen met het zoetsmakende eiwit thaumatine. De biochemische eigenschappen, structuur en industriële toepassingen van thaumatine worden besproken. Verder worden de activiteiten die worden toegekend aan TLPs beschreven en verklaard. Bij de aanvang van dit onderzoek waren enkel de dertig eerste aminozuren van TLXI gekend. Kennis van de volledige aminozuursequentie is echter de eerste vereiste om inzicht te krijgen in de inhibitiedeterminanten van een eiwit. Een moleculair biologische benadering is de benadering bij uitstek om de nucleotidesequentie en bijgevolg de aminozuursequentie te achterhalen van TLXI. De moleculaire identificatie van het TLXI coderende gen in hexaploide tarwe vormt dan ook het onderwerp van hoofdstuk drie. De volledige aminozuursequentie van TLXI werd voor de eerste keer beschreven. De DNA, mRNA en aminozuursequenties kunnen worden teruggevonden in de NCBI databank onder Accession numbers AJ786602, AJ786601 en CAH10283, respectievelijk. Verder liet een analyse van de promoterregio ons toe om suggesties te formuleren omtrent de biologische functie van deze inhibitor. Bovendien konden er ook tlxi-achtige sequenties geïdentificeerd worden in diploide tarwesoorten en in rogge. Om een mutationele analyse uit te kunnen voeren op TLXI, moest er eerst een expressiesysteem ontwikkeld worden. De optimalisatie van de expressie in Pichia pastoris door verschillende parameters te variëren, wordt uiteengezet in hoofdstuk vier. De optimale expressiecondities die hier werden bepaald, werden in volgende experimenten gebruikt voor de productie van TLXI. De biochemische karakterisering van het recombinant aangemaakte en opgezuiverde eiwit wordt beschreven in hoofdstuk vijf. Deze karakterisering bevestigde dat inderdaad een xylanase inhibitorgen geïsoleerd werd en stelde ons in staat om de eigenschappen van recombinant TLXI (rTLXI) te vergelijken met deze van natief TLXI. Door de nieuwheid van het eiwit en door het gebrek aan structurele informatie, bleef het inhibitiemechanisme van TLXI onduidelijk. Moeilijkheden om TLXI en zijn complex met een xylanase te kristalliseren dwongen ons om een alternatieve route te volgen om inzicht te verwerven in het inhibitiemechanisme. Hoofdstuk zes beschrijft hoe, gebaseerd op een moleculair model en op een vergelijkende analyse van TLXI, TAXI en TLPs, residu’s werden geselecteerd voor mutagenese. Recombinante expressie van de mutanten en daaropvolgende inhibitietesten worden beschreven en resulteerden in de identificatie van His22 als de belangrijkste inhibitiedeterminant. Gebaseerd op deze bevindingen werd een docking model gecreëerd van het xylanase-TLXI complex in de veronderstelling dat TLXI, zoals TAXI en XIP, een competitieve inhibitor is. Een andere, complementaire, benadering om residu’s te identificeren die betrokken zijn in de inhibitieactiviteit en –specificiteit is de expressie en karakterisering van gerelateerde sequenties, beschreven in hoofdstuk zeven. De resultaten bevestigden de resultaten verkregen door de mutagenese studie. Tenslotte bekijken we in hoofdstuk acht de xylanase kant van de interactie om het docking model, voorgesteld in hoofdstuk zes, te valideren. Vooreerst werd het gen coderend voor A. niger xylanase (exlA) tot expressie gebracht in P. pastoris en werd het opgezuiverde eiwit gebruikt om een kinetische test te optimaliseren in multiwell platen. Mutatie van een aminozuur dat werd gesuggereerd deel te nemen aan de interactie met TLXI toonde aan dat het voorgestelde docking model niet correct is. Bovendien werd door kinetische studies op het Laboratorium voor Levensmiddelenchemie aangetoond dat TLXI aan niet-competitieve inhibitor is. Door de beperkte capaciteit van docking programma’s wat betreft niet-competitieve inhibitoren, kon er geen nieuw model worden voorgesteld. Er worden wel nieuwe hypothesen geformuleerd om de inhiberende capaciteit van TLXI te verklaren.status: publishe

Alteration of Bacillus subtilis XynA endoxylanase substrate selectivity by site-directed mutagenesis

Bacillus subtilis endoxylanase XynA was engineered by site-directed mutagenesis to alter its substrate selectivity, i.e. the ratio of its capacity to solubilise water-unextractable arabinoxylans (WU-AX) to its capacity to hydrolyse water-extractable AX (AE-AX). Four surface exposed aromatic residues were targeted for mutation to alanine, either individually (Y113 and W185) orjointly (F48, Y94, Y113 and W185), based on the general role of aromatic residues in the binding of endoxylanases to insoluble substrates and the hypothesis that they affect the activity of endoxylanases towards WU-AX. Determination of the substrate selectivity factors and WU-AX degradation profile of the wild type and mutant enzymes using an elaborate procedure requiring incubation of native wheat flour WU-AX and WE-AX with different enzyme levels showed that mutants W185A and 4mutA, the mutant containing all four mutations, displayed lower selectivity towards WU-AX than the wild type recombinant endoxylanase. Each of the endoxylanases had similar binding activity to wheat flour WU-AX and insoluble oat spelt xylan. (c) 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.status: publishe

Engineering molecular recognition of endoxylanase enzymes and their inhibitors through phage display

Specific binding of interacting proteins generally depends on a limited set of amino acid residues located at the contact interface. We have applied a phage-display-based screening method to simultaneously evaluate the role of multiple residues of endo-beta-1,4-xylanase enzymes in conferring binding specificity towards two different endoxylanase inhibitors. Seven residues of the two beta-strand 'thumb' region of Trichoderma longibrachiatum endo-beta-1,4-xylanase XynII were targeted for randomization. The generated combinatorial library representing 62,208 site-directed variants was displayed on the surface of filamentous phage and selected against xylanase inhibitor protein (XIP) and Triticum aestivum xylanase inhibitor (TAXI). DNA sequence analysis of phagemid panning isolates provided information on the occurrence of particular amino acids at distinct positions. In particular, residues at positions 124 (Asn) and 131 (Thr) were found to be critical for specific inhibitor binding. These residue predictions derived from the combinatorial exploration of the thumb region and accompanying sequence analyses were experimentally confirmed by testing the inhibitor sensitivity of a limited set of recombinantly expressed XynII mutants. In addition, we successfully altered the inhibition susceptibility of the bacterial Bacillus subtilis endoxylanase XynA from XIP-insensitive to XIP-sensitive.status: publishe

Molecular identification of wheat endoxylanase inhibitor TAXI-II and the determinants of its inhibition specificity

Wheat grains contain Triticum aestivum xylanase inhibitor (TAXI) proteins which inhibit microbial xylanases, some of which are used in cereal based food industries. These inhibitors may play a role in plant defence. Among the TAXI isoforms described so far, TAXI-II displays a deviating inhibition specificity pattern. Here, we report on the molecular identity of TAXI-II and the basis of its inhibition specificity. Three candidate TAXI-II encoding sequences were isolated and recombinantly expressed in Pichia pastoris. To identify TAXI-II, the resulting proteins were tested against glycoside hydrolase family (GHF) 11 xylanases of Aspergillus niger (ANX) and Bacillus subtilis (BSX). One of these proteins (rTAXI-IB) inhibited both enzymes, like natural TAXI-I. The other candidates (rTAXI-IIA and rTAXI-IIB) showed an inhibition pattern typical for natural TAXI-II, only clearly inhibiting BSX. Comparative analysis of these highly similar sequences with distinct inhibition activity patterns, combined with information on the structural basis for ANX inhibition by TAXI-I [S. Sansen, C.J. De Ranter, K. Gebruers, K. Brijs, C.M. Courtin, J.A. Delcour, A. Rabijns, Structural basis for inhibition of Aspergillus niger xylanase by Triticum aestivum xylanase inhibitor-I, J. Biol. Chem. 279 (2004) 36022-36028], indicated a crucial role for Pro294 of TAXI-IIA and Gln376 of TAXI-IIB in determining the reduced inhibition activity towards ANX. Consequently, single point mutants rTAXI-IIA[P294L] and rTAXI-IIB[Q376H], both displaying the Leu/His combination corresponding to TAXI-I, were able to inhibit ANX. These results show that TAXI-II inhibition specificity bears on the identity of two key residues at positions 294 and 376, which are involved in the interaction at the -2 glycon subsite and the active site of GHF 11, respectively.status: publishe

Crystal structure of the noncompetitive xylanase inhibitor TLXI, member of the small thaumatin-like protein family

The crystal structure of the thaumatin-like xylanase inhibitor (TLXI) from Triticum aestivum, a non-competitive inhibitor of glycoside hydrolase family 11 xylanases, has been determined at 2.9 Å resolution. It is similar to that of thaumatin except that TLXI lacks domain II of thaumatin, making it the first obtained crystallographic structure in the small thaumatin-like proteins (TLPs) subfamily within the larger family of TLPs. Unlike most other TLPs, TLXI does not contain the acidic surface cleft which is responsible for antifungal activity and binding of carbohydrates. Comparison with other TLPs suggests the loop containing histidine 22 as being important for xylanase inhibition.status: publishe

His22 of TLXI plays a critical role in the inhibition of glycoside hydrolase family 11 xylanases

Recently, a novel wheat thaumatin-like protein, TLXI, which inhibits microbial glycoside hydrolase family (GH) 11 xylanases has been identified. It is the first xylanase inhibitor that exerts its inhibition in a non-competitive way. In the present study we gained insight into the interaction between TLXI and xylanases via combined molecular modeling and mutagenic approaches. More specifically, site-specific mutation of His22, situated on a loop which distinguishes TLXI from other, non-inhibiting, thaumatin-like proteins, and subsequent expression of the mutant in Pichia pastoris resulted in a protein lacking inhibition capacity. The mutant protein was unable to form a complex with GH11 xylanases. Based on these findings, the interaction of TLXI with GH11 xylanases is discussed.status: publishe

Targeted molecular engineering of a family 11 endoxylanase to decrease its sensitivity towards Triticum aestivum endoxylanase inhibitor types

The Bacillus subtilis endoxylanase XynA (BSXY) is frequently used to improve the functionality of arabinoxylan-containing material in cereal based industries. The presence of endogenous Triticum aestivum xylanase inhibitors (TAXI-I and TAXI-II) in wheat is a real concern as they have a direct negative impact on the efficiency of this enzyme. Here, we used the recently determined structure of the complex between TAXI-I and an endoxylanase of Aspergillus niger to develop inhibitor-insensitive BSXY variants by site-directed mutagenesis of strategically chosen amino acids. We either induced steric hindrance to reject the inhibitors or interrupted key interactions with the inhibitors in the endoxylanase substrate-binding groove. The first strategy was successfully applied to position G12 where G12W combined inhibition insensitivity with unharmed catalytic performance. Variants from the second strategy showed altered inhibitor sensitivities concomitant with changes in enzyme activities and allowed to gain insight in the binding-mode of both TAXI-I and TAXI-II with BSXY.status: publishe

TLXI, a novel type of xylanase inhibitor from wheat (Triticum aestivum) belonging to the thaumatin family

Wheat (Triticum aestivum) contains a previously unknown type of xylanase (EC 3.2.1.8) inhibitor, which is described in the present paper for the first time. Based on its >60% similarity to TLPs (thaumatin-like proteins) and the fact that it contains the Prosite PS00316 thaumatin family signature, it is referred to as TLXI (thaumatin-like xylanase inhibitor). TLXI is a basic (pI≥9.3 in isoelectric focusing) protein with a molecular mass of approx. 18–kDa (determined by SDS/PAGE) and it occurs in wheat with varying extents of glycosylation. The TLXI gene sequence encodes a 26-amino-acid signal sequence followed by a 151-amino-acid mature protein with a calculated molecular mass of 15.6–kDa and pI of 8.38. The mature TLXI protein was expressed successfully in Pichia pastoris, resulting in a 21–kDa (determined by SDS/PAGE) recombinant protein (rTLXI). Polyclonal antibodies raised against TLXI purified from wheat react with epitopes of rTLXI as well as with those of thaumatin, demonstrating high structural similarity between these three proteins. TLXI has a unique inhibition specificity. It is a non-competitive inhibitor of a number of glycoside hydrolase family 11 xylanases, but it is inactive towards glycoside hydrolase family 10 xylanases. Progress curves show that TLXI is a slow tight-binding inhibitor, with a Ki of approx. 60–nM. Except for zeamatin, an α-amylase/trypsin inhibitor from maize (Zea mays), no other enzyme inhibitor is currently known among the TLPs. TLXI thus represents a novel type of inhibitor within this group of proteins