Aspectos estruturais da mucilagem de Pereskia aculeata, Mill (ora pro nóbis)

Orientador: Dr. João Batista Chaves CorrêaTese (Doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Curso de Pós-Graduação em BioquímicaInclui referências: p. 115-134Resumo: A extração aquosa, a 50°, do pó acetônico de folhas de Pereskia aculeata , deu origem a um material mucilaginoso que , após precipitação com cetavlon e tratamento de SEVAG, originou o polissacarídeo P. Esse, contém 3,5% de proteína e é constituído por unidades de arabinose, galactose, ramnose e ácido galacturônico numa relação molar de respectivamente 5,1: 8,2: 1,8: 1,0. A análise cromatográfica do polissacarídeo P, colorido com Azul de Procion, em coluna de Sephadex, bem como a de fracionamento em coluna de DEAE-celulose, indicaram que o mesmo é polidisperso. Os espectros de 13C-n.m.r em D2O das três principais frações obtidas em DEAE - celulose , F-2, F-3 e F-7 mostraram sinais correspondentes às unidades de arabinofuranose e ramnopiranose e, para F-2 e F-3, também de éster metílico. Além disso, esses espectros foram bem mais definidos do que aqueles do polissacarídeo P em D2O e em DMS0- 2H6, que apresentou cinco sinais de arabinofuranose, correspondentes aqueles da fração F-2, e que aparecem sobrepostos a alguns extremamente amplos. Esses últimos correspondem as unidades de galactose, cujo movimento molecular é limitado, provavelmente, devido a própria complexação dos polissacarídeos. Essa estrutura baseada em pontes de hidrogénio, foi, então, dissociada após a passagem através da coluna de DEAE-celulose, As técnicas convencionais de analise química indicaram que o polissacarídeo P, possui na cadeia principal unidades de -D galactopiraranose interligadas (1 - 4) e parcialmente substituídas em 0-3 por unidades de B - L arabinopiraranoses, que são por seu turno di- 0 - substituídas em 0-2 e 0-4 por outros terminais não redutores de a - L arabinopiraranoses. As unidades de ácido galacturônico estão presentes internamente ou como grupos terminais não redutores ligados (1 - 2) as unidades de ramnopiranose. Na análise por B - eliminação em meio alcalino, ficou demonstrado, que a ligação polissacarídeo - proteína, ocorre entre arabinose e hidroxiprolina, enquanto que o tratamento do polissacarídeo P com lítio metálico em etilenodiamina, originou um produto B - degradado, através das unidades de ácido galacturônico esterificadas. Além de outros constituintes o complexo arabinogalactana- proteína apresenta 25 moles% de grupos 0-acetil. A localização dos grupos 0-acetil, como foi determinada pelo método de BOUVENG, ocorre principalmente como 3 - 0 - acetil -arabinopiranose (12%), 3-0-aceti 1-ramnopiranose (11%) e 2 - 0 - aceti 1-gal actopiranose (3%) e foi determinada por g.l.c-m.s através da análise dos 0-metil alditóis acetatos em coluna de DB-210 que, mostrou ser a mais eficiente, para a separação dos derivados de arabinitol. A distribuição mais exata foi efetuada substituindo os grupos 0 - acetil por 0 - tri deuterometil, formando um polissacarídeo que foi sequencialmente 0 - metilado e convertido em acetatos de alditóis parcialmente deutero - 0 - metilados. A análise por g.l.c-m.s , interpretada juntamente com o mecanismo de fragmentação por i . e ., mostrou que no heteropolímero os grupos 0 - acetil estão distribuídos em mais do que uma posição de um mesmo açúcar. A solução aquosa do heteropolissacarídeo P que apresenta viscosidade máxima entre pH 4,4 -5,6 a temperatura ambiente, sofre redução dessa propriedade reolõgica, tanto pela presença de sais como pela variação do pH . Todavia, apresenta a mesma viscosidade em diferentes temperaturas.Abstract: 1. Aqueous extraction at 50° of the leaves of Pereskia aculeata gave rise to a mucilaginous material, which after Cetavlon precipitation and Sevag treatment, provided purified polysaccharide P containing 3.5% protein and units of arabinose, galactose, rhamnose and galacturonic acid in a 5.1: 8.2 :1.8: 1.0 molar ratio. Dyeing with Procion Blue, followed by fractionation on columns of Sephadex and of DEAE-cellulose showed that P was polydisperse. 2. DEAE- c e l1ulose column chromatography of P gave 3 o 13 main fractions F-2, F-3, and F-7. Their C-n.m.r spectra, in D2 O solution, were well defined with recognizable signals cor responding to arabinofuranosyl and rhamnopyranosyl units, and in the case of F-2 and F-3, methyl ester. These spectra were much better defined than those of P in D2 O and in DMS0- Hg, which consisted mainly of 5 sharp signals of arabinofuranose, corresponding to those of fractions F-2, superimposed on e x tremely broad ones. The latter arise from material consisting main ly of galactosyl units, whose molecular motion is limited probably by high complexation of the compoments p o lysaccharides .Such a structure based on hydrogen bonding was thus dissociated on passage through the DEAE-celulose column. 3. Overall chemical analysis of P , using conventional chemical techniques ,showed a main chain consisting of (1 4 )- inked-g-Q-galactopyranosyl units partly substituted at 0 - 3 with residues of B - L - a r abinopyranose , which are in turn, di-0- substituted at 0-2 and 0-4 with nonreducing end-groups of a-Larabinouranose . Galacturonic acid units are present as nonre ducing end-groups, or as internal ones linked (1 + 2 ) to rhamnopyranosyl residues. 4. The polysaccharide-protein linkage in P was found to consist of units of arabinose combined to hydrox y p r o 1 i n e , and the presence of galacturonic acid residues esterified with m e thyl groups was consistent with degradation via 6-elimination of polysaccharide P in ethylenediamine containing lithium. 5. Heteropolysaccharide P was also found to contain 25 moles % of 0-acetyl groups, which were located by the method of BOUVENG. £-Acetyl groups were replaced with those of 0-methyl and the partly 0-methylated polysaccharide converted to amixture of -methylalditol acetates, which was examined by g.l.cm. s , on DB-210, which is efficient in separating the arabinitol derivatives. Characterized were acetates of 3-0^-methyl arabinitol (12%), 3-0-methylrhamnitol (11%), and 2 -0-methylgalactitol (3%). A more exact distribution of 0-acetyl groups was achieved via a similar replacement, but incorporating trideute romethylation, followed by conversion to a mixture of corres ponding trideuteromethylated alditol acetates. G.l.c-m.s analy sis showed the location of the ester group in each type of struc: tural unit and that they occurred not in one position but are distributed throughout the available hydroxyl groups of each unit. 6 . Maximum viscosity pf polysaccharide P was observed at 25 and at pH 4.4 to 5.6 . Reduction of viscosity occurred on addition of salts, but is invariable with the temperature

Alguns aspectos químicos, físico-químicos e estruturais da mucilagem extraída de folhas de Pereskia aculeata Mill

Reproduçao eletrostaticaOrientador: Joao Batista Chaves CorreaDissertaçao (mestrado) -Universidade Federal do Paraná. Curso de Pós-Graduaçao em BioquímicaBibliografia: f. 63-77Resumo: O pó acetônico tratado com benzeno-etanol (2:1, v/v) de folhas de Pereskia aculeata, foi submetido a exaustiva extração com água quente e o extrato, após precipitação etanólica, forneceu um heteropolissacarídeo mucilaginoso. Após sucessivas desproteinizações, pelo método de Sevag, o polímero apresentou 36,01 de acucar total e a seguinte composição: ramnose, 9,2%; fucose, 2,5%; ribose, 2,51; arabinose, 27,51; xilose, 2,5%; manose, 3,0%;ga lactose, 40,8%, glucose, 3,0%, acido-D-galacturonico, 9% e mioinositol, calculado em relação ao açúcar total, 4,2%. A amostra continha, ainda, proteína, 3,51; acetil, 6,72%; cálcio, l,91%;fosfato, 0,48%, sendo esses valores expressos em relação ao peso seco. As analises físico-químicas de uma solução a 0,4283g% de mucilagem d20 = 0,9839 g/ml, forneceram os seguintes dados: µ abs20 = 444 cps; [µ20 ]= 7,0 (100 ml/g) na faixa de pH de 4,4 a 5,6; [µ25 ]= 7,9(100 ml/g) em pH 4,7; µred decrescente pela adição de iods [?]D25 -29,4 (0,1542 g% de polissacarídeo). As filtrações em géis de Sepharose 6B e Sephadex + G200, indicaram único pico simétrico e a possibilidade de P.M. inferior a 2 x 106, comparado ao do Blue Dextran; a eletroforese em acetato de celulose apresentou única banda, embora difusa. A hidrolise acida parcial indicou a presença de formas piranosidicas e furanosidicas para as unidades de arabinose e galactose. A dosagem pela galactose oxidase realizada no polímero indicou que apenas 8,7% das unidades de galactose, eram suscetíveis a ação da enzima. 0 polissacarídeo apresentou um consumo de periodato e uma liberação de acido fórmico, respectivamente, de 1,22 e 0,62 .moles por mol de açúcar anidro. A analise por metilação dos oligossacarídeos ácidos, obtidos por hidrolise com T.F.A. e separados em resina AG1-X10 , forma acetato, indicou possíveis ligações (1 -? 2) entre as unidades de ácido-D-galacturonico e ramnose, e (1 ->4) entre as unidades de ramnose e o ácido-D-galacturonico. A metilação do polissacarídeo confirmou a presença de formas furanosidicas para as unidades de galactose (34,51) e arabinose (25,51), alem de 11,51 de galactopiranose e 3,0% de ara binopiranose. A avaliação dos dados obtidos pelas hidrolises acidas parciais, oxidação com periodato, degradação de Smith e metilação sugere que o polissacarídeo de Vnfizokla ac.ulo.ata e composto por 18% de unidades de gal ligadas atraves (1 -> 6), das quais 9,0 % possuem ramificações em C-3 ou vice-versa, por 121 de unidades de gala ligadas através (1 -> 5) , das quais 9,0% possuem ramificações em C-2 e 3% ramificações em C-3. 0 polímero e formado, ainda, por 13% de unidades de ara$, das quais 6,5% acham-se ligadas através (1 ->5) e 6,5% através (1 -> 3) ; por 7% de unidades de galp , ligadas através (1 -? 4) das quais 3,0% apresentam ramificações em C-6, e por 4,5% galp ligadas através (1 -> 6). A definição estrutural dessa macromolécula, sua analise química e seu comportamento físico-químico são, entretanto , dificultados por sua própria complexidade molecular

Aspectos estruturais da mucilagem de Pereskia aculeata, Mill (ora pro nóbis)

Orientador: Dr. João Batista Chaves CorrêaTese (Doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Curso de Pós-Graduação em BioquímicaInclui referências: p. 115-134Resumo: A extração aquosa, a 50°, do pó acetônico de folhas de Pereskia aculeata , deu origem a um material mucilaginoso que , após precipitação com cetavlon e tratamento de SEVAG, originou o polissacarídeo P. Esse, contém 3,5% de proteína e é constituído por unidades de arabinose, galactose, ramnose e ácido galacturônico numa relação molar de respectivamente 5,1: 8,2: 1,8: 1,0. A análise cromatográfica do polissacarídeo P, colorido com Azul de Procion, em coluna de Sephadex, bem como a de fracionamento em coluna de DEAE-celulose, indicaram que o mesmo é polidisperso. Os espectros de 13C-n.m.r em D2O das três principais frações obtidas em DEAE - celulose , F-2, F-3 e F-7 mostraram sinais correspondentes às unidades de arabinofuranose e ramnopiranose e, para F-2 e F-3, também de éster metílico. Além disso, esses espectros foram bem mais definidos do que aqueles do polissacarídeo P em D2O e em DMS0- 2H6, que apresentou cinco sinais de arabinofuranose, correspondentes aqueles da fração F-2, e que aparecem sobrepostos a alguns extremamente amplos. Esses últimos correspondem as unidades de galactose, cujo movimento molecular é limitado, provavelmente, devido a própria complexação dos polissacarídeos. Essa estrutura baseada em pontes de hidrogénio, foi, então, dissociada após a passagem através da coluna de DEAE-celulose, As técnicas convencionais de analise química indicaram que o polissacarídeo P, possui na cadeia principal unidades de -D galactopiraranose interligadas (1 - 4) e parcialmente substituídas em 0-3 por unidades de B - L arabinopiraranoses, que são por seu turno di- 0 - substituídas em 0-2 e 0-4 por outros terminais não redutores de a - L arabinopiraranoses. As unidades de ácido galacturônico estão presentes internamente ou como grupos terminais não redutores ligados (1 - 2) as unidades de ramnopiranose. Na análise por B - eliminação em meio alcalino, ficou demonstrado, que a ligação polissacarídeo - proteína, ocorre entre arabinose e hidroxiprolina, enquanto que o tratamento do polissacarídeo P com lítio metálico em etilenodiamina, originou um produto B - degradado, através das unidades de ácido galacturônico esterificadas. Além de outros constituintes o complexo arabinogalactana- proteína apresenta 25 moles% de grupos 0-acetil. A localização dos grupos 0-acetil, como foi determinada pelo método de BOUVENG, ocorre principalmente como 3 - 0 - acetil -arabinopiranose (12%), 3-0-aceti 1-ramnopiranose (11%) e 2 - 0 - aceti 1-gal actopiranose (3%) e foi determinada por g.l.c-m.s através da análise dos 0-metil alditóis acetatos em coluna de DB-210 que, mostrou ser a mais eficiente, para a separação dos derivados de arabinitol. A distribuição mais exata foi efetuada substituindo os grupos 0 - acetil por 0 - tri deuterometil, formando um polissacarídeo que foi sequencialmente 0 - metilado e convertido em acetatos de alditóis parcialmente deutero - 0 - metilados. A análise por g.l.c-m.s , interpretada juntamente com o mecanismo de fragmentação por i . e ., mostrou que no heteropolímero os grupos 0 - acetil estão distribuídos em mais do que uma posição de um mesmo açúcar. A solução aquosa do heteropolissacarídeo P que apresenta viscosidade máxima entre pH 4,4 -5,6 a temperatura ambiente, sofre redução dessa propriedade reolõgica, tanto pela presença de sais como pela variação do pH . Todavia, apresenta a mesma viscosidade em diferentes temperaturas.Abstract: 1. Aqueous extraction at 50° of the leaves of Pereskia aculeata gave rise to a mucilaginous material, which after Cetavlon precipitation and Sevag treatment, provided purified polysaccharide P containing 3.5% protein and units of arabinose, galactose, rhamnose and galacturonic acid in a 5.1: 8.2 :1.8: 1.0 molar ratio. Dyeing with Procion Blue, followed by fractionation on columns of Sephadex and of DEAE-cellulose showed that P was polydisperse. 2. DEAE- c e l1ulose column chromatography of P gave 3 o 13 main fractions F-2, F-3, and F-7. Their C-n.m.r spectra, in D2 O solution, were well defined with recognizable signals cor responding to arabinofuranosyl and rhamnopyranosyl units, and in the case of F-2 and F-3, methyl ester. These spectra were much better defined than those of P in D2 O and in DMS0- Hg, which consisted mainly of 5 sharp signals of arabinofuranose, corresponding to those of fractions F-2, superimposed on e x tremely broad ones. The latter arise from material consisting main ly of galactosyl units, whose molecular motion is limited probably by high complexation of the compoments p o lysaccharides .Such a structure based on hydrogen bonding was thus dissociated on passage through the DEAE-celulose column. 3. Overall chemical analysis of P , using conventional chemical techniques ,showed a main chain consisting of (1 4 )- inked-g-Q-galactopyranosyl units partly substituted at 0 - 3 with residues of B - L - a r abinopyranose , which are in turn, di-0- substituted at 0-2 and 0-4 with nonreducing end-groups of a-Larabinouranose . Galacturonic acid units are present as nonre ducing end-groups, or as internal ones linked (1 + 2 ) to rhamnopyranosyl residues. 4. The polysaccharide-protein linkage in P was found to consist of units of arabinose combined to hydrox y p r o 1 i n e , and the presence of galacturonic acid residues esterified with m e thyl groups was consistent with degradation via 6-elimination of polysaccharide P in ethylenediamine containing lithium. 5. Heteropolysaccharide P was also found to contain 25 moles % of 0-acetyl groups, which were located by the method of BOUVENG. £-Acetyl groups were replaced with those of 0-methyl and the partly 0-methylated polysaccharide converted to amixture of -methylalditol acetates, which was examined by g.l.cm. s , on DB-210, which is efficient in separating the arabinitol derivatives. Characterized were acetates of 3-0^-methyl arabinitol (12%), 3-0-methylrhamnitol (11%), and 2 -0-methylgalactitol (3%). A more exact distribution of 0-acetyl groups was achieved via a similar replacement, but incorporating trideute romethylation, followed by conversion to a mixture of corres ponding trideuteromethylated alditol acetates. G.l.c-m.s analy sis showed the location of the ester group in each type of struc: tural unit and that they occurred not in one position but are distributed throughout the available hydroxyl groups of each unit. 6 . Maximum viscosity pf polysaccharide P was observed at 25 and at pH 4.4 to 5.6 . Reduction of viscosity occurred on addition of salts, but is invariable with the temperature

Alguns aspectos químicos, físico-químicos e estruturais da mucilagem extraída de folhas de Pereskia aculeata Mill

Reproduçao eletrostaticaOrientador: Joao Batista Chaves CorreaDissertaçao (mestrado) -Universidade Federal do Paraná. Curso de Pós-Graduaçao em BioquímicaBibliografia: f. 63-77Resumo: O pó acetônico tratado com benzeno-etanol (2:1, v/v) de folhas de Pereskia aculeata, foi submetido a exaustiva extração com água quente e o extrato, após precipitação etanólica, forneceu um heteropolissacarídeo mucilaginoso. Após sucessivas desproteinizações, pelo método de Sevag, o polímero apresentou 36,01 de acucar total e a seguinte composição: ramnose, 9,2%; fucose, 2,5%; ribose, 2,51; arabinose, 27,51; xilose, 2,5%; manose, 3,0%;ga lactose, 40,8%, glucose, 3,0%, acido-D-galacturonico, 9% e mioinositol, calculado em relação ao açúcar total, 4,2%. A amostra continha, ainda, proteína, 3,51; acetil, 6,72%; cálcio, l,91%;fosfato, 0,48%, sendo esses valores expressos em relação ao peso seco. As analises físico-químicas de uma solução a 0,4283g% de mucilagem d20 = 0,9839 g/ml, forneceram os seguintes dados: µ abs20 = 444 cps; [µ20 ]= 7,0 (100 ml/g) na faixa de pH de 4,4 a 5,6; [µ25 ]= 7,9(100 ml/g) em pH 4,7; µred decrescente pela adição de iods [?]D25 -29,4 (0,1542 g% de polissacarídeo). As filtrações em géis de Sepharose 6B e Sephadex + G200, indicaram único pico simétrico e a possibilidade de P.M. inferior a 2 x 106, comparado ao do Blue Dextran; a eletroforese em acetato de celulose apresentou única banda, embora difusa. A hidrolise acida parcial indicou a presença de formas piranosidicas e furanosidicas para as unidades de arabinose e galactose. A dosagem pela galactose oxidase realizada no polímero indicou que apenas 8,7% das unidades de galactose, eram suscetíveis a ação da enzima. 0 polissacarídeo apresentou um consumo de periodato e uma liberação de acido fórmico, respectivamente, de 1,22 e 0,62 .moles por mol de açúcar anidro. A analise por metilação dos oligossacarídeos ácidos, obtidos por hidrolise com T.F.A. e separados em resina AG1-X10 , forma acetato, indicou possíveis ligações (1 -? 2) entre as unidades de ácido-D-galacturonico e ramnose, e (1 ->4) entre as unidades de ramnose e o ácido-D-galacturonico. A metilação do polissacarídeo confirmou a presença de formas furanosidicas para as unidades de galactose (34,51) e arabinose (25,51), alem de 11,51 de galactopiranose e 3,0% de ara binopiranose. A avaliação dos dados obtidos pelas hidrolises acidas parciais, oxidação com periodato, degradação de Smith e metilação sugere que o polissacarídeo de Vnfizokla ac.ulo.ata e composto por 18% de unidades de gal ligadas atraves (1 -> 6), das quais 9,0 % possuem ramificações em C-3 ou vice-versa, por 121 de unidades de gala ligadas através (1 -> 5) , das quais 9,0% possuem ramificações em C-2 e 3% ramificações em C-3. 0 polímero e formado, ainda, por 13% de unidades de ara$, das quais 6,5% acham-se ligadas através (1 ->5) e 6,5% através (1 -> 3) ; por 7% de unidades de galp , ligadas através (1 -? 4) das quais 3,0% apresentam ramificações em C-6, e por 4,5% galp ligadas através (1 -> 6). A definição estrutural dessa macromolécula, sua analise química e seu comportamento físico-químico são, entretanto , dificultados por sua própria complexidade molecular