UTILIZAÇÃO DO TESTE HIPOSMÓTICO PARA AVALIAR A EFICÁCIA DE DIFERENTES PROTOCOLOS DE CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN CAPRINO

Este estudo teve por objetivo comparar a eficácia de quatro protocolos de congelação do sêmen caprino (glicerol, glicerol+EDTA; etilenoglicol; etilenoglicol+EDTA), através da utilização do teste hiposmótico (HOST). O sêmen foi colhido de dois machos da raça Alpina, sexualmente maduros, diluído nos diferentes meios, congelado e armazenado em nitrogênio líquido. Após a colheita, 20ìL do sêmen fresco foram incubados com 01mL de solução hiposmótica (combinação de citrato de sódio e frutose em água destilada com osmolaridade de 125mOsmol), em banho-maria a 370C por 30 minutos. Este procedimento foi repetido após a descongelação e, em seguida, uma amostra foi colocada sobre lâmina/lamínula e avaliada em contraste de fase com mil vezes de aumento. Um total de 100 células foi contado, e as médias percentuais de espermatozóides com edema ou dobramento de cauda, após o HOST, foram – para o sêmen fresco, glicerol, glicerol+EDTA; etilenoglicol; etilenoglicol+EDTA –, respectivamente, 53,89; 16,90; 10,25; 52,64 e 57,54. PALAVRAS-CHAVE: Caprinos, criopreservação, sêmen, teste hiposmótic

Efeito de um quelante de cálcio, um detergente e da lecitina de soja sobre a qualidade do sêmen caprino congelado-descongelado

The aim of this paper was verifying the effect of the Equex STM Paste and EDTA addition to a Tris-egg yolk extender, on the post-thaw goat sperm viability. Nine semen samples of two adult goats were collected by artificial vagina and cryopreserved. It was also objective of this study, to evaluate the utilization of a soybean lecithin based commercial extender (Bioexcell® - IMV, L'Aigle, French) for the goat semen freezing. They were formed five experimental groups: TRIS; TRIS+EDTA; TRIS+EQUEX; TRIS+EDTA+EQUEX e Bioexcell. After evaluation, the semen was diluted in the five extenders and packed in 0.25mL straws with 100 million of motile spermatozoa. The samples were cooled at 0,46°C/min to 5°C, submitted at 75min of equilibration time and frozen in liquid nitrogen vapour. The thawing was accomplished in 37ºC water bath for 50s. There were no differences (P>;0,05) on the means of post-thaw total and progressive sperm motility among the groups TRIS, TRIS+EQUEX and TRIS+EQUEX+EDTA. The Bioexcell group obtained the least (P<0,05) percentage of post-thawing total and progressive sperm motility. After the thermotolerance test, it was observed the greatest (P<0,05) rates of total and progressive sperm motility in the Equex STM groups (TRIS+EQUEX and TRIS+EQUEX+EDTA). Thus, it can be affirmed that the Equex addition promotes better maintenance rates in the pos-thaw sperm viability, when compared with the extenders that did not contain it.Nove amostras de sêmen de dois caprinos adultos, colhidas com a utilização de vagina artificial, foram submetidas a criopreservação, com o objetivo de verificar o efeito do Equex STM Paste e do EDTA, adicionados a um diluidor a base de Tris-gema de ovo, sobre a viabilidade espermática pós-descongelação. Também foi objetivo desse trabalho, avaliar a utilização de um diluidor comercial, a base de lecitina de soja (Bioexcell® - IMV, L'Aigle, França), para a congelação do sêmen caprino. Assim, foram formados cinco grupos experimentais: TRIS; TRIS+EDTA; TRIS+EQUEX; TRIS+EQUEX+EDTA e Bioexcell. Logo depois da avaliação, o sêmen foi diluído nos diferentes meios e envasado em palhetas de 0,25 mL, com dose inseminante de 100 x 10(6) espermatozóides. As amostras foram submetidas ao resfriamento, com uma curva média de 0,46°C/min, até atingirem a temperatura de 5°C, mantidas por mais 75min em tempo de equilíbrio e, posteriormente, congeladas em nitrogênio líquido. A descongelação foi realizada em banho-maria a 37ºC por 50s. Não houve diferença (P>;0,05) entre as médias de motilidade total e progressiva, em relação aos grupos TRIS, TRIS+EQUEX e TRIS+EQUEX+EDTA. O grupo Bioexcell obteve o menor (P<0,05) percentual de espermatozóides com motilidade total e progressiva após a descongelação. Após o teste de termoresistência, as melhores (P<0,05) taxas de motilidade total e progressiva foram observadas para os grupos com Equex STM (TRIS+EQUEX e TRIS+EQUEX+EDTA). Assim, pode-se afirmar que a adição do Equex promove uma maior manutenção das taxas de viabilidade espermática após a descongelação, quando comparado com os diluidores que não o continham

UTILIZAÇÃO DE GLICEROL E ETILENOGLICOL COMO CRIOPROTETORES NA CONGELAÇÃO DO SÊMEN CAPRINO

Dez amostras de sêmen de dois reprodutores caprinos, da raça Parda-alpina, colhidas em vagina artificial, foram submetidas a quatro tratamentos para avaliação da eficiência do etilenoglicol e do glicerol, associados ou não ao EDTA, na criopreservação da célula espermática caprina. O diluente usado era à base de Tris-gema de ovo contendo 7% de glicerol (glicerol E glicerol+EDTA) ou 7% de etilenoglicol (etilenoglicol e etilenoglicol + EDTA), sendo que nos grupos glicerol+EDTA e etilenoglicol+EDTA foi associado ao diluente 0,1% de EDTA. As amostras foram mantidas por 60 minutos em geladeira a 40C, onde então era efetuada a congelação em nitrogênio (-1960C). A descongelação foi realizada em banho-maria a 370C por 30segundos. As médias obtidas para motilidade (%) a descongelação, para os grupos glicerol, glicerol+EDTA, etilenoglicol, etilenoglicol+EDTA, foram, respectivamente, 51%; 61%; 10% e 12%. Os grupos que utilizaram o glicerol como crioprotetor obtiveram melhores taxas de motilidade pós-descongelação, principalmente quando foi associado ao diluidor o EDTA (grupo glicerol+EDTA). Porém, esse resultado foi comprometido pelos maiores índices de alterações patológicas nos grupos que continham o glicerol. PALAVRAS-CHAVE: Caprinos, criopreservação, sêmen, glicerol, etilenoglicol, EDT

AVALIAÇÃO IN VITRO DO SÊMEN CAPRINO RESFRIADO, COM OU SEM CENTRIFUGAÇÃO DO PLASMA SEMINAL E DILUÍDO EM LEITE DESNATADO-GLICOSE E TRIS-GEMA DE OVO

O objetivo deste trabalho foi comparar in vitro quatro tratamentos para o resfriamento de sêmen caprino, a partir de 32 ejaculados de quatro bodes, submetidos aos diluidores tris-gema de ovo e leite desnatado-glicose, e processados com ou sem centrifugação do plasma seminal. O sêmen foi resfriado e conservado a 4º C durante 48 horas.Os resultados foram expressos em média e desvio padrão e submetidos a ANOVA (P0,05). Conclui-se que o diluidor tris-gema de ovo preservou melhor(p0,05) as características seminais avaliadas, exceto em relação à patologia de cauda. PALAVRAS-CHAVE: Caprino, centrifugação, diluidor, resfriamento, sêmen

EFEITO DA SOLUÇÃO, DA FIXAÇÃO EM FORMOL-SALINA E DO TEMPO DE INCUBAÇÃO SOBRE OS RESULTADOS DO TESTE HIPOSMÓTICO PARA SÊMEN EQÜINO CONGELADO

Este experimento objetivou determinar o melhor protocolo de teste hiposmótico (HO) para avaliar a integridade funcional da membrana plasmática dos espermatozóides eqüinos submetidos à criopreservação. Foram avaliadas três soluções HO (água destilada, frutose 100 mOsmol/L e citrato de sódio 100 mOsmol/L), os tempos de incubação de 0, 15 e 30 minutos dependendo do tipo de solução utilizada e o processo de fixação ou não em formol-salina. Após a descongelação do sêmen foram retiradas alíquotas de sêmen para incubação nas três soluções HO. Decorridos os tempos de incubação (0, 15 e 30 minutos), retirou-se uma alíquota de sêmen para leitura do percentual de espermatozóides reativos ao teste HO e fixou-se, em formolsalina, o restante da mistura sêmen/solução HO para posterior leitura e comparação entre as leituras fixadas versus não fixadas. Não houve diferença (P>0,05) entre os tempos de incubação independente da solução HO utilizada. A água destilada apresentou maior percentagem de espermatozóides reativos ao teste no protocolo que não usou a fixação em formol, entretanto apresentou resultado semelhante às amostras incubadas em frutose e citrato de sódio, no protocolo que utilizou a fixação em formol. Não houve diferença (P>0,05) na comparação, por solução, da leitura fixada versus não fixada.
 PALAVRAS-CHAVE: Eqüino, sêmen congelado, teste hiposmótic

What is the most suitable hypoosmotic swelling test to assess functional integrity of cryopreserved equine sperm?

ABSTRACT. Snoeck P.P.N., Melo M.I.V., Alves S.G.G., Bittencourt R.F., Ribeiro Filho A.L., Chalhoub M. & Henry M. [What is the most suitable hypoosmotic swelling test to assess functional integrity of cryopreserved equine sperm?] Qual é o teste hiposmótico mais indicado para avaliar a integridade funcional de espermatozoides equino criopreservados? Revista Brasileira de Medicina Veterinária, 36(4):355-361, 2014. Departamento de Ciências Agrárias e Ambientais, Universidade Estadual de Santa Cruz, Rodovia Jorge Amado, Km 16, Salobrinho, Ilhéus, BA 45662-000, Brasil. E-mail: [email protected] The aim of this work was to standardize the most efficient hypoosmotic swelling test (HOST) to determine the percentage of functional integrity of cryopreserved equine sperm by testing protocols with different solutes and distilled water, different incubation times in water bath, osmolarities, dilution rates and with or without formol-saline fixation. In experiment 1 the sucrose, fructose, sodium chloride and sodium citrate solutions with 50 and 100 mOsmol/L and the distilled water were tested in the dilutions rate of 1:10 and 1:20, incubated in water bath for 10 and 15 minutes. The types of hypoosmotic reaction were evaluated in phase contrast microscopy. There were no differences (P≥0.05) between the incubation times, osmolarities of solutions, and dilution rates of the semen with distilled water. The fructose solution was more efficient to determine the percentage of reactive sperm (P≤0.05) than the sodium chloride and sodium citrate solutions, but was similar to sucrose and distilled water (P≥0.05). The test with distilled water identified the higher percentage of reactive sperm with strongly coiled tails compared to the tests with hypoosmotic solutions with 50 and 100mOsmol/L (P≤0.05). Experiment 2 tested the semen and distilled water dilutions to perform the HOST (1:5, 1:10, 1:15, 1:20 and 1:25). The 1:15 distilled water HOST was superior when compared to the other protocols (P≤0.05), and was similar to the 1:25 dilution protocol (P≥0.05). The effect of the saline-formol fixation was studied in experiment 3. The semen:distilled water dilution rate used was 1:15. After water bath incubation the sperm were immediately assessed or fixed for later analysis. There were no differences (P≥0.05) in the comparison between the fixed and non fixed protocol. The most efficient HOST to determine the percentage of functional integrity of cryopreserved equine sperm is carried out with 1:15 water distilled dilution (semen:distilled water), incubated for 10 minutes, fixed in saline-formol solution; the immediate reading is not necessar