Protective Immunity to Mycobacterium tuberculosis Infection by Chemokine and Cytokine Conditioned CFP-10 Differentiated Dendritic Cells

BACKGROUND: Dendritic cells (DCs) play major roles in mediating immune responses to mycobacteria. A crucial aspect of this is the priming of T cells via chemokines and cytokines. In this study we investigated the roles of chemokines RANTES and IP-10 in regulating protective responses from Mycobacterium tuberculosis (M. tb) 10 kDa Culture Filtrate Protein-10 (CFP-10) differentiated DCs (CFP10-DCs). METHODS AND FINDINGS: Infection of CFP10-DCs with mycobacteria down-modulated RANTES and IP-10 levels. Pathway specific microarray analyses showed that in addition to RANTES and IP-10, mycobacteria infected CFP10-DCs showed reduced expression of many Th1 promoting chemokines and chemokine receptors. Importantly, T cells co-cultured with RANTES and IP-10 conditioned CFP10-DCs mediated killing of mycobacteria from infected macrophages. Similarly, T cells recruited by RANTES and IP-10 conditioned CFP10-DCs mediated significant killing of mycobacteria from infected macrophages. IFN-gamma treatment of CFP10-DCs restored RANTES and IP-10 levels and T cells activated by these DCs mediated significant killing of virulent M. tb inside macrophages. Adoptive transfer of either RANTES and IP-10 or IL-12 and IFN-gamma conditioned CFP10-DCs cleared an established M. tb infection in mice. The extent of clearance was similar to that obtained with drug treatment. CONCLUSIONS: These results indicate that chemokine and cytokine secretion by DCs differentiated by M. tb antigens such as CFP-10 play major roles in regulating protective immune responses at sites of infection

Development of lentiviral vectors for the gene therapy of HIV infection

Drug toxicity and viral resistance limit long-term efficacy of antiviral drug treatment for HIV infection. Thus, alternative therapies need to be explored. Previously, group of “Prof. von Laer” tested the infusion of T lymphocytes transduced with a retroviral vector (M87o) that expresses an HIV entry inhibitory peptide (maC46). Gene-modified autologous T cells were infused into 10 HIV-infected patients with advanced disease and multidrug resistant virus during antiretroviral combination therapy. T cell infusions were tolerated well with no severe side effects. A significant increase of CD4 counts was observed post infusion. At the end of the one-year follow-up, the CD4 counts of all patients were still around or above baseline. Gene-modified cells could be detected in peripheral blood, lymph nodes and bone marrow throughout the oneyear follow-up, whereby marking levels correlated with the cell dose. No significant changes of viral load were observed during the first four months. Four of the seven patients that changed their antiviral drug regimen thereafter responded with a significant decline in plasma viral load. In conclusion, the transfer of gene-modified cells was safe, led to sustained levels of gene marking and may improve immune competence in HIV-infected patients with advanced disease and multidrug resistant virus. However, the low level of gene marking and the lack of substantial long-term in vivo accumulation of gene-protected cells observed in this trial clearly demonstrate the requirement for new vectors with new strategy. In this thesis self‐inactivating lentiviral vectors harboring internal promoters and RNA elements were therefore evaluated for their potential use in a clinical gene‐therapy trial. The results from this work provide the basis for the selection of a suitable candidate vector for extensive preclinical testing. Apart from being capable of transducing non‐dividing cells, lentiviral vectors incorporate a number of additional features that are of potential value for gene therapeutic applications. These include a larger packaging capacity, higher titers than γ‐retroviral vectors and, most importantly, a reduced risk of deregulating cellular genes due to its natural integration profile. The use of internal promoters to drive expression of the therapeutic transgene maC46 should further improve the safety profile of these new‐generation vectors, while an additional artificial splice acceptor (SA) into the 5‟UTR of the transgene over all elevate transgene expression. The rationale for this is that hematopoietic stem and progenitor cells will be Summary 98 protected from enhancer‐mediated transactivation effects and also from potential side effects due to the aberrant expression of maC46 while at the same time the full clinical benefit for the patients is maintained. In order to find a suitable candidate for preclinical studies, two candidate therapeutic vectors harboring different regulatory elements were selected based on results from pilot experiments. The internal promoters used to drive expression of codon optimized maC46 were the PGK promoter and MPSV promoter. This work focuses on the transgene expression levels in lymphoid cells and antiviral activity. The issues of long term expression, propensity to methylation mediated silencing of the promoters, and genotoxicity were also touched. In a first step the performance of different vectors was evaluated in the human T cell lines. Based on promising data from ex vivo human peripheral blood mononuclear cells, the vector carrying the MPSV promoter along with intron were selected for in vivo transplantation experiments. In summary, the ex vivo data suggested the long term survival of lentiviral gene modified cells, along with maintained expression of introduced genes. It was observed that the expression of these constructs depends strongly on the activation and differentiation status of the targeted T cells. This regulation was not linked to any specific promotor. In vivo study shows that maC46 can be introduced into murine multiple hematopoietic lineages via lentiviral vector and expressed at high levels in their mulilineage progeny, without altering the hematopoiesis. There was no sign of any kind of hematopoietic or lymphoid malignancies. Although gene-modified lymphocytes persisted in-vivo, the downregulation of transgene expression was consistent with the ex-vivo observation. In contrast to that the T cells transplanted group showed delayed engraftment of donor cells and there was no expression of C46 in blood and lymphatic organs. . In conclusion, when considering HIV gene therapy focusing CD4+ T cells, potential problems of T cell activation status as related to the desired clinical effect must be addressed. These results might open the way for a gene therapy targeting mainly or exclusively activated T cells and could be exploited for immunostimulatory as well as suppressive approaches.Trotz des bemerkenswerten klinischen Erfolgs der vor etwa 15 Jahren eingeführten Standardbehandlung der HIV-Infektion, HAART (highly active anti retroviral therapy), ist die Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien, weiterhin notwendig, da bisher weder eine effiziente Impfung noch eine kurative Behandlung entwickelt werden konnte. Im Zuge der Suche nach neuen Therapieansätzen wurde eine Reihe von zellulären und viralen Zielstrukturen identifiziert, die essentiell für die HIV Replikation sind und als Ansatzpunkte für innovative Gentherapiestrategien dienen. Unter anderem wurden bereits RNA-basierte Ansätze verfolgt, wie z.B. Ribozyme, RNA Fängersequenzen (decoys), antisense mRNAs sowie Strategien der RNA Interferenz. Auf Proteinebene wurden dominant-negative Virusproteine sowie sog. Intrabodies (zytoplasmatisch lokalisierte Antikörper) als Therapieansatz verfolgt. Diese Strategien weisen jedoch immanente Probleme auf, die eine Heilung der HIV Infektion letztlich nicht herbeiführen können. Ein weiterer Therapieansatz, der auf der Gabe synthetischer, vom viralen Glykoprotein (gp) 41 abgeleiteter Peptide beruht, inhibiert die HIV Replikation im niedrigen nanomolaren Konzentrationsbereich. Die sogenannten C-Peptide, in Form von T20 (Enfuvirtide, Fuzeon®) sind als Medikament zugelassen. Enfuvirtide ist ein synthetisches C-Peptid, das einem 36 Aminosäure umfassenden Bereich in der Heptad-Repeat (HR) - 2 Domäne in gp41 entspricht. Es bindet an den HR1 Domänentrimer von gp41, sodass die Formierung des Sechs-Helix-Bündels verhindert und somit die Fusion der zellulären und viralen Membranen inhibiert wird. Die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Dorothee von Laer hat in den Jahren 2004-2006 in zusammenarbeit mit dem Universitäts-klinikum Hamburg Eppenheim eine klinische Phase I/II Studie durchgeführt, in der autologe T-Zellen von 10 HIV+ Patienten gentherapeutisch in der Art modifiziert wurden, dass sie eine membranverankerte (ma) Variante eines C-peptids, dem sogenannten maC46 auf deren Zelloberfläche exprimieren. C46 entspricht, wie T20, einem Bereich der extrazellulären Domäne des gp41 Proteins ist allerdings N-terminal um zehn Aminosäuren verlängert und besitzt dadurch verbesserte Eigenschaften in Bezug auf virale Resistenzmutationen. Die maC46 transduzierten Zellen wurden nach Expansion wieder den Patienten reinfundiert. Die Transgenexpression wurde von einem -retroviralen Vektor (M87o) Zusammenfassung 100 gesteuert. Die genmodifizierten T-Zellen zeigten in vorangegangenen in vitro und in vivo Experimenten, einen selektiven Vorteil gegenüber nicht modifizierten T-Zellen unter dem Selektionsdruck einer aktiven HIV-1 Replikation und eine Absenkung des Gesamtvirusreplikation in Form einer erniedrigten p24 Protein Viruslast. Im Ergebnis der klinischen Studie konnte allerdings weder eine Absenkung der Plasmavirämie noch eine Akkumulation transgener T-Zellen, trotz eines transienten CD4+ Anstiegs nach Zellreinfusion, beobachtet werden. Zusammenfassend lässt sich an dieser Stelle festhalten, dass der Therapieansatz mit peripheren T-Zellen aus vielschichtigen Gründen nicht erfolgreich war. In Kürze sind hier vor allem (i) die Limitation der transduzierbaren Zielzellen des Virus (1x109; entsprechend nur 1% der Gesamtzielzellpopulation), (ii) der stark Fortgeschrittene Krankheitsverlauf der 10 Patienten der Studie sowie (iii) ein verminderter Selektionsdruck der Virusreplikation im Patienten im Vergleich zu den präklinischen in vitro und in vivo Analysen. Fortschritte auf dem Gebiet der stammzellbasierten Therapieansätze sowie Entwicklungen im Bereich des Vektordesigns haben die verwendung von hematopoetischen stammzellen (HSCs) als zielzellen einer HIV-Gentherapie ermöglicht. Hematopoetische Stammzellen (HSCs) sind auf Grund ihrer Eigenschaft der Selbsterneuerung und der Differenzierung in alle Zellarten des hematopoetischen Systems wichtige Zielzellpopulationen im Gentherapiesektor, da sie die Möglichkeit einer lebenslangen Genkorrektur in allen hematopoetischen Zelltypen bieten. Nach 20 Jahren intensiver Vektorentwicklung, präklinischen Testungen sowie ersten klinischen Studien ist die Gentherapie mit HSCs Realität geworden. Dabei konnte bereits in einigen Studien ein klinischer Nutzen für die Patienten gezeigt werden. Die effizienteste Art des Gentransfers in HSCs konnte bisher durch -retrovirale oder durch die neueren lentiviralen Vektoren erzielt werden. Die Verwendung von lentiviralen Vektoren hat das Potential die in klinischen Studien aufgetretenen Probleme der bisher verwendeten -retroviralen Vektoren zu überwinden; unter anderem Insertionsmutagenese (oder Transaktivierung zellulärer Gene durch Integration der viralen Genome in der Nähe von transkriptionellen Startregionen), niedriges Anwachsen transgener Stammzellen sowie geringe Langzeit-Transgenexpressionslevel. Lentivirale Vektoren der dritten Generation, wie sie auch in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden, besitzen die zusätzliche Sicherheitsmaßnahme, dass im viralen Genom die Enhancer- Funktion in der 3‟-long terminal repeat Region (LTR) deletiert wurde. Diese Deletion wird im Zusammenfassung 101 reversen Transkriptionsprozess auch auf die 5‟LTR übertragen, sodass die Transgenexpression nicht mehr durch die LTR sondern von einem internen Promotor getreiben wird. Diese Konfiguration der selbst-inaktivierenden (SIN) lentiviralen Vektoren besitzt eine vielfach reduzierte Genotoxizität im Vergleich zu den LTR getriebenen -retroviralen Vektoren. Die Eigenschaft der lentiviralen Vektoren auch ruhende Zellen effizient transduzieren zu können ermöglicht eine stark verkürzte Kultivierungszeit der HSCs, welche wiederum eine verbesserte Repopulierungskapazität der transgenen HSCs im Patienten zur Folge hat. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Testung von zwei Promotoren in Bezug auf die Verwendbarkeit in klinischen Studien zur HIV Gentherapie. Für einen Vergleich der relativen Promotoraktivität (pHR´) wurde zum einen der konstitutiv-aktive, zelluläre Phosphoglyceratkinase-Promotor (PGK) und zum anderen der virale Myeloproliferative sarcoma virus Promotor (MPSV) in das Vektorrückrad eines SIN lentiviralen Vektors kloniert, sodass die jeweiligen Promotoren die Expression des antiviralen Transgens maC46 steuern. Für eine optimierte RNA Prozessierung wurde eine künstliche Spleißakzeptordomäne in die 5‟ nichttranslatierte Region (5‟-UTR) des Transgenkassette kloniert. Des Weiteren verfügten alle verwendeten Vektoren über ein post-transkriptionelles regulatorisches Element (PRE) des Woodchuck Hepatits Virus (Biber Hepatitis Virus) in der 3‟ nicht-translatierten Region der Transgenkassette, um einen verbesserten Vektortiter zu erhalten. Sowohl die eingefügte Spleißakzeptorsequenz als auch das wPRE erhöhten in den durchgeführten Experimenten die allgemeinen Transgenexpressionslevel. Die Expression von maC46 in der T-zelline PM-1 war unter der Kontrolle des MPSV Promotors signifikant stärker im Vergleich zum PGK Promotor. Die jeweiligen Intron tragenden Varianten der beiden Promotorkonstrukte erzielten höhere Transgenexpressionslevel als die Vektoren ohne Intron. Als nächstes wurden die verschiedenen Konstrukte in HIV Infektionsexperimenten getestet, ob sie maC46 transduzierte Zelllinien effizient vor Infektion schützen können. Es zeigte sich, dass der Fusionsinhibitor maC46 in HIV infizierten Mischkulturen transduzierter und nativer Zellen eine starke positive Selektion transduzierter Zellen vermittelt. Zusammenfassung 102 Um die Tauglichkeit der neuen Vektoren für die Gentherapie weiter zu analysieren, wurden humane primäre periphere Blutlymphozyten mit den beschriebenen Vektoren transduziert und in Bezug auf Transgenexpressionstärke und Expressionsdauer untersucht. Die Expression eines Transgens variiert generell auf Grund der verschiedenen Stadien der Zellaktivierung. Die Expression von maC46 fluktuierte über den gesamten Beobachtungszeitraum je nach Aktivierungsstatus der T-Zellen mit den höchsten maC46 Expression zu Beginn der Kultur (entsprechend der T-Zellaktivierung, gemessen anhand der CD25+ Oberflächenexpressionslevel). Die geringste Expression wurde 14 Tage nach Transduktion beobachtet; korrelierend mit einem niedrigen Aktivierungsstatus der T-Zellen (niedrige CD25-Expression). Northern Blot Analysen der Gesamt-RNA aus transduzierten Zellen an verschiedenen Zeitpunkten zeigten, dass die maC46 Proteinabnahme mit einer geringeren mRNA Menge korreliert. Eine Restimulierung der TZellen bewirkte eine Reaktivierung der maC46 Expression zu vergleichbaren Proteinlevels wie zu Beginn des Experiments. In Arbeiten anderer Gruppen konnte gezeigt werden, dass in den 3‟ Regionen der HIV-1 mRNAs Zielsequenzen zellulärer Mikro-RNAs (miRNAs) lokalisiert sind, die nur in ruhenden aber nicht in aktivierten CD4-T-Zellen exprimiert werden. Um eine miRNA induzierte Translationsinhibition ausschließen zu können, wurde die miRNA-28 Zielsequenz im Kontext eines bidirektionellen Promotors analysiert. Dabei wurden die Expressionslevel zweier Transgene (LNGFR und eGFP) relativ zueinander verglichen. Beide Transgene wurden gleich stark im Zuge der Inaktivierung der T-Zellen herunterreguliert, sodass ein Einfluss der miRNA-28 ausgeschlossen werden konnte. Zusätzlich wurde eine Bisulfitsequenzanalyse auf den CpG Bereichen des MPSV-Promotors durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass der Promotor über den gesamten zeitlichen Verlauf nur zu geringem Anteil methyliert wurde, sodass der Promotor prinzipiell transkriptionell aktiv in humanen Lymphozyten ist. Langzeitkulturen transduzierter PBLs zeigten eine Abnahme in der Transgenexpression, was letztlich die Integrationsfähigkeit der verwendeten Vektoren oder die Fitness transduzierter Zellen in Frage stellt. qPCR Analysen konnten zeigen, dass die Transgenexpressionabnahme nicht durch einen Vektorkopienverlust hervorgerufen wurde. Eine vergleichende Analyse der Lanzeitexpression von vier verschiedenen Vektoren mit zwei unterschiedlichen Transgenkassetten (eGFP und maC46) und zwei unterschiedlichen Promotoren (SFFV und MPSV) ergab ebenfalls Zusammenfassung 103 eine stabile Vektorkopienzahl bzw. eine Abnahme der Transgenexpression in Abhängigkeit der TZellaktivierung. In einem weiteren Schritt sollten die Beobachtungen aus den in vitro Experimenten in einem Knochenmarkstransplantations-Mausmodel bestätigt werden. Hierfür wurden Knochenmarkszellen einer immunkompetenten Maus entnommen und mit verschiedenen lentiviralen Konstrukten für maC46 transduziert. Nach isogener Transplantation konnte gezeigt werden, dass maC46 in verschiedenen lymphoiden Zelltypen, unter anderem Monozyten und CD4+ T-Zellen, in hohen Konzentrationen exprimiert wurde. Es konnte kein signifikanter Unterschied in der maC46 Expression zwischen myleoiden und lymphoiden Zellen festgestellt werden. Gleichzeitig wurde beobachtet, dass die Ausdifferenzierung der HSCs durch die maC46 Expression, auch bei hohen Transgenkonzentrationen, nicht gestört wurde, sodass eine Stammzelltoxizität des maC46 wahrscheinlich nicht vorliegt. Untersuchungen des peripheren Blutes HSC-transplantierter Tiere zeigten stabile Transgenlevel in myeloiden Zellen und B-Zellen. In CD4+ T-Zellen wurde nach anfänglicher Verminderung der Transgenmengen eine stabile Expressionsstärke von maC46 beobachtet, die über den Beobachtungszeitraum von über 20 Wochen stabil war. Der Verlust der Expressionsstärke korreliert mit dem Verlust an transgenen Zellen besonders im Zeitraum von 10 bis 14 Wochen. Der beobachtete Verlust an maC46 Expression in CD4 T-Zellen unterstrich die Hypothese des transkriptionellen Abschaltens in Abhängigkeit des T-Zellaktivierungsstatus. Eine detaillierte Endanalyse der lymphatischen Organe zeigte eine hohes Maß an Chimerismus in sekundären lymphatischen Organen (Lymphknoten, Milz und Knochenmark) sowie eine maC46 Positivität bis zu 60% in CD4-T-Zellen. Gleichzeitig lag die DNA Vektorkopienzahl weit über den zu erwarteten Kopien pro Zelle ausgehend von der maC46 Expressionsstärke; wiederum ein Anzeichen für transkriptionelles Abschalten der maC46 Expression. In einem weiteren Experiment wurden reife periphere T-Zellen mit maC46 kodierende lentivirale Vektoren transduziert und in immundefiziente Mäuse transplantiert. Das Transplantat zeigte ein verzögertes Angehen der Zellen, wobei nur nicht transduzierte Zellen nachzuweisen waren. Blut und sekundäre lymphatische Organe zeigten ein geringes Maß an maC46 Kopien im Vergleich zum Transplantat. Eine detaillierte Analyse von Tieren, die mit verschiedenen MOI (Multiplizität der Infektion) transduzierten PBL injiziert wurden, zeigte keine signifikanten Unterschiede in der Zusammenfassung 104 maC46 Expression bzw. Kopienzahl in Blut, Milz und Lymphknoten. Hieraus kann eine mögliche VSV-G Toxizität im Verlauf der Transduktion prinzipiell ausgeschlossen werden. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit subsumieren, dass eine CD4 T-Zell-fokussierte Gentherapie dem grundlegenden Problem der Transgenexpression in Abhängigkeit des Aktivierungsstatus der jeweiligen Zelle gegenübersteht. Da diese Abhängigkeit der Transgene expression vom Aktivierungszustand der T-Zelle für T-Zellen, die in-vivo aus transgenen HSCs differenziert sind, weniger aus geprägt zu sein scheint, sollten künftige klinische studien zur HIV-Gentherapie mit stammzellen durchgeführt werden

Generation of X-CGD cells for vector evaluation from healthy donor CD34+ HSCs by shRNA-mediated knock down of gp91phox

Innovative approaches for the treatment of rare inherited diseases are hampered by limited availability of patient derived samples for preclinical research. This also applies for the evaluation of novel vector systems for the gene therapy of monogenic hematological diseases like X-linked chronic granulomatous disease (X-CGD), a severe primary immunodeficiency caused by mutations in the gp91phox subunit of the phagocytic NADPH oxidase. Since current gene therapy protocols involve ex vivo gene modification of autologous CD34+ hematopoietic stem cells (HSC), the ideal preclinical model should simulate faithfully this procedure. However, the low availability of patient-derived CD34+ cells limits the feasibility of this approach. Here, we describe a straightforward experimental strategy that circumvents this limitation. The knock down of gp91phox expression upon lentiviral delivery of shRNAs into CD34+ cells from healthy donors generates sufficient amounts of X-CGD CD34+ cells which subsequently can be used for the evaluation of novel gene therapeutic strategies using a codon-optimized gp91phox transgene. We have used this strategy to test the potential of a novel gene therapy vector for X-CGD

Enhanced Thermostability of Silica-immobilized Lipase from Bacillus coagulans BTS-3 and Synthesis of Ethyl Propionate

A lipase from the thermophilic isolate Bacillus coagulans BTS-3 was produced and purified. The enzyme was purified 40-fold to homogeneity by ammonium sulfate precipitation and DEAE-Sepharose column chromatography. Its molecular weight was 31 kDa on SDS-PAGE. The purified lipase was immobilized on silica and its binding efficiency was found to be 60%. The enzyme took 60 min to bind maximally onto the support. The pH and temperature optima of immobilized lipase were same as those of the free enzyme, i.e. 8.5 and 55ºC, respectively.  The immobilized enzyme had shown marked thermostability on the elevated temperatures of 55, 60, 65 and 70ºC. The immobilized enzyme was reused for eigth cycles as it retained almost 80% of its activity. The catalytic activity of immobilized enzyme was enhanced in n-hexane and ethanol. The immobilized enzyme when used for esterification of ethanol and propionic acid showed 96% conversion in n-hexane in 12 h at 55ºC