HrpE, the major component of the Xanthomonas type three protein secretion pilus, elicits plant immunity responses

Like several pathogenic bacteria, Xanthomonas infect host plants through the secretion of effector proteins by the Hrp pilus of the Type Three Protein Secretion System (T3SS). HrpE protein was identified as the major structural component of this pilus. Here, using the Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) HrpE as a model, a novel role for this protein as an elicitor of plant defense responses was found. HrpE triggers defense responses in host and non-host plants revealed by the development of plant lesions, callose deposition, hydrogen peroxide production and increase in the expression levels of genes related to plant defense responses. Moreover, pre-infiltration of citrus or tomato leaves with HrpE impairs later Xanthomonas infections. Particularly, HrpE C-Terminal region, conserved among Xanthomonas species, was sufficient to elicit these responses. HrpE was able to interact with plant Glycine-Rich Proteins from citrus (CsGRP) and Arabidopsis (AtGRP-3). Moreover, an Arabidopsis atgrp-3 knockout mutant lost the capacity to respond to HrpE. This work demonstrate that plants can recognize the conserved C-Terminal region of the T3SS pilus HrpE protein as a danger signal to defend themselves against Xanthomonas, triggering defense responses that may be mediated by GRPs.Fil: Gottig Schor, Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Vranych, Cecilia Verónica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Sgro, Germán Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Piazza, Ainelén Melanie. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Ottado, Jorgelina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

The type III protein secretion system contributes to Xanthomonas citri subsp. citri biofilm formation

Background: Several bacterial plant pathogens colonize their hosts through the secretion of effector proteins by a Type III protein secretion system (T3SS). The role of T3SS in bacterial pathogenesis is well established but whether this system is involved in multicellular processes, such as bacterial biofilm formation has not been elucidated. Here, the phytopathogen Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) was used as a model to gain further insights about the role of the T3SS in biofilm formation. Results: The capacity of biofilm formation of different X. citri T3SS mutants was compared to the wild type strain and it was observed that this secretion system was necessary for this process. Moreover, the T3SS mutants adhered proficiently to leaf surfaces but were impaired in leaf-associated growth. A proteomic study of biofilm cells showed that the lack of the T3SS causes changes in the expression of proteins involved in metabolic processes, energy generation, exopolysaccharide (EPS) production and bacterial motility as well as outer membrane proteins. Furthermore, EPS production and bacterial motility were also altered in the T3SS mutants. Conclusions: Our results indicate a novel role for T3SS in X. citri in the modulation of biofilm formation. Since this process increases X. citri virulence, this study reveals new functions of T3SS in pathogenesis.Fil: Zimaro, Tamara. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Thomas, Ludivine. King Abdullah University Of Science And Technology;Fil: Marondedze, Claudius. King Abdullah University Of Science And Technology;Fil: Sgro, Germán Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Garofalo, Cecilia Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Ficarra, Florencia Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Gehring, Chris. King Abdullah University Of Science And Technology;Fil: Ottado, Jorgelina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Gottig Schor, Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Participación de las proteínas del sistema de secreción tipo III de Xanthomonas axonopodis pv. citri, Hpa1 y HrpE, en la interacción planta patógeno

La Cancrosis de los Cítricos es considerada en la actualidad una de las enfermedades más peligrosas y perjudiciales para la citricultura en Argentina y en el mundo, debido a los daños causados en la producción y calidad de los frutos, siendo Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) la bacteria fitopatógena responsable de esta enfermedad. Las bacterias fitopatógenas colonizan a sus hospedadores a través de la secreción de proteínas mediante el Sistema de Secreción de Tipo III (SST3). Este sistema está codificado por el cluster hrp, el cual es esencial para la patogenicidad en plantas hospedadoras y la inducción de HR en plantas no hospedadoras. El cluster hrp de Xac contiene un gen que codifica para una proteína harpin llamada Hpa1. Las harpin son proteínas estables al calor, ricas en glicina, que pueden formar poros en membranas, inducir HR en algunas plantas y formar estructuras fibrilares. Con el objetivo de estudiar la función de la proteína Hpa1 de Xac en la patogenicidad, se expresó y se purificó esta proteína en forma recombinante, y se generó la cepa mutante de Xac en el gen hpa1. A través de diversos estudios analizando los fenotipos generados tanto en plantas hospedadoras como no hospedadoras, la expresión de sus genes en respuesta a la Hpa1, y los efectos que produce esta proteína sobre las células bacterianas, se logró determinar que la misma posee un rol dual en la patogenicidad de Xac, por un lado promoviendo la inducción de la respuesta de defensa basal de las plantas, y por otro aumentando la virulencia del patógeno, probablemente causando cambios en la estructura del mesófilo de las hojas de cítricos y promoviendo la agregación de las células bacterianas. A su vez, se realizaron estudios utilizando técnicas biofísicas con la intención de comprender el funcionamiento de esta proteína, al mismo tiempo que se estudiaron dos dominios de la misma con el objetivo de caracterizar sus roles dentro de la proteína. Esto permitió estudiar la relación estructura-función de Hpa1 con mayor detalle. Se determinó que ambos dominios inducen HR en tejidos de plantas no hospedadoras, mientras que la capacidad de formación de fibras y de agregar células bacterianas es particular y propia de la región amino terminal de la proteína. Por otro lado, el gen hrpE perteneciente también al cluster hrp de Xac codifica para la proteína pilina que constituye el Pilus Hrp del SST3. Se estudiaron nuevos roles para esta proteína, determinando los efectos que produce la misma en las plantas. Así se logró determinar que HrpE es reconocida tanto por plantas hospedadoras como no hospedadoras. En el caso de las plantas no hospedadoras, las mismas respondieron desarrollando HR, deposición de calosa y producción de ROS, y un aumento en la expresión de genes relacionados con respuestas de defensa, mientras que en naranja todas esta respuestas fueron significativamente más leves en intensidad. Además, fue encontrada una nueva función para esta pilina promoviendo el priming tanto en plantas hospedadoras como no hospedadoras, disminuyendo el grado de infección de Xac y del fitopatógeno Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), causante de la enfermedad Mancha o Sarna Bacteriana en plantas de tomate y pimiento. Al mismo tiempo se analizó la factibilidad del uso de anticuerpos contra esta pilina, como estrategia para la obtención de plantas resistentes a la Cancrosis de los Cítricos. De esta forma, se encontró una significativa disminución de los efectos producidos tanto por HrpE recombinante como por Xac y Xcv en plantas de naranja, validando esta estrategia para el futuro desarrollo de plantas resistentes que expresen transgénicamente estos anticuerpos. Las proteínas blanco de naranja encontradas a través del ensayo de doble híbrido en levaduras para HrpE y Hpa1, mostraron una diversa variedad de funciones, entre ellas, se encontraron proteínas cuyos genes se ven inducidos, o forman parte de la defensa, frente a algún estrés tanto biótico como abiótico; proteínas pertenecientes a los mecanismos de degradación de otras proteínas; enzimas involucradas en el metabolismo, ya sea primario o secundario; proteínas relacionadas al ciclo celular; enzimas involucradas en el mantenimiento de la homeostasis redox de la célula; proteínas de membrana tanto quinasas sensoras como transportadores de iones o azucares; enzimas involucradas en la producción de fitohormonas; y proteínas relacionadas con el reordenamiento y la muerte celular.Fil: Sgro, Germán Gustavo. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina

A Novel Saliva RT-LAMP Workflow for Rapid Identification of COVID-19 Cases and Restraining Viral Spread

Rapid diagnostics is pivotal to curb SARS-CoV-2 transmission, and saliva has emerged as a practical alternative to naso/oropharyngeal (NOP) specimens. We aimed to develop a direct RT-LAMP (reverse transcription loop-mediated isothermal amplification) workflow for viral detection in saliva, and to provide more information regarding its potential in curbing COVID-19 transmission. Clinical and contrived specimens were used to optimize formulations and sample processing protocols. Salivary viral load was determined in symptomatic patients to evaluate the clinical performance of the test and to characterize saliva based on age, gender and time from onset of symptoms. Our workflow achieved an overall sensitivity of 77.2% (n = 90), with 93.2% sensitivity, 97% specificity, and 0.895 Kappa for specimens containing >102 copies/μL (n = 77). Further analyses in saliva showed that viral load peaks in the first days of symptoms and decreases afterwards, and that viral load is ~10 times lower in females compared to males, and declines following symptom onset. NOP RT-PCR data did not yield relevant associations. This work suggests that saliva reflects the transmission dynamics better than NOP specimens, and reveals gender differences that may reflect higher transmission by males. This saliva RT-LAMP workflow can be applied to track viral spread and, to maximize detection, testing should be performed immediately after symptoms are presented, especially in females