Search for molecular defects in women with premature ovarian insufficiency

Background: The etiology of premature ovarian insufficiency (POI) is multifactorial and may include genetic and/or environmental factors. Nevertheless, the etiology remains unknown in 90% of the cases, which are classified as idiopathic. Although in ~30% of women with POI the disease has a familiar pattern, in only ~7% a molecular defect has been identified.Αim of the study: The aim of the study was to search for genetic defects in genes related to the development and/or function of the ovary and are linked to POI: FOXL2, BMP15, GDF9, FOXE1 and NOBOX. We hypothesized that causative molecular defects could be identified more frequently in cases with early onset of POI and that analysis of multiple genes in the same population sample could disclose existence of more than one molecular aberration in the same patient.Subjects and Methods: 38 subjects with onset of POI at an early age (mean age 17.4 ± 6.6 years) were included in the study. Bidirectional sequencing of the coding region of FOXL2, FOXE1, BMP15, NOBOX and GDF9 genes was performed. In addition, MLPA was applied in cases in which deletion and/or duplication needed to be excluded. Fifty female subjects from the general Greek population served as controls for the genes FOXL2, BMP15 and NOBOX, and seventy five for the gene FOXE1.Validation of results: The validation of the results was performed by in silico analysis, ab initio 3D protein modeling and by comparing the frequency of the identified genetic variants between patients with POI and controls from the Greek population, as well as, between patients and subjects of the European population of the 1000 Genome Project (1000 GP). Results: In the FOXL2 gene, a novel, de novo, heterozygous deletion (p.K150Rfs*121) was detected in one subject (2.6%). In the FOXE1 gene, a novel aberrant alanine tract was detected with genotype 8/16 in two patients and genotype 8/14 in one patient (normal genotypes: 14/14 or 16/16). Three more patients with aberrant alanine tract were detected with genotypes 12/16, 15/16 and 14/17, respectively. In the control group one individual had a FOXE1 alanine tract with a genotype of 8/14. In the BMP15 gene, the mutation p.Q115H/WT was detected in one subject, in none of our controls or the 1000 GP population. In silico analysis predicted that the mutation p.Q115H was damaging in 5/8 programmes. The mutation p.A180T/WT of the BMP15 gene was detected in 2.6% of the patients, 0% of our control group and 0.5% of the 1000 GP population. In silico analysis predicted that the variant p.A180T was damaging in 2/8 programmes. However, ab initio protein modeling predicted that the p.A180T disrupted the 3D structure of the corresponding BMP15 protein. The genotype c.-9C>G + p.N103S of the BMP15 gene was detected in homozygosity in 5.2% of the patients, 0% of our controls and 0.5% of the 1000 GP population (p: 0.075). All the identified variants in the NOBOX gene were classified as polymorphisms. No missense variants were detected in the GDF9 gene. In five patients, molecular aberrations in two genes in the same subject were identified.Conclusions: Genetic variants in five genes were searched for in patients with relatively early onset of ovarian insufficiency (mean age 17.4 ± 6.6 years). The percentage of genetic variants identified, as possibly related, to the phenotype in our patients with POI was much higher than previously reported (44.7% vs. 7%). The increased incidence of molecular defects in our POI group could be attributed to the younger age of POI onset in our group and the analysis of multiple genes in the same population sample. The existence of genetic aberrations in two genes in five subjects with POI, possibly indicates digenic inheritance, a phenomenon already described in other nosologic entities. The early recognition of genetic defects in women with POI has not only theoretical but also practical interest. The precise etiology of POI can determine more accurately the prognosis, guide the genetic counseling and facilitate planning fertility strategies (cryopreservation).Γνωσιολογικό Υπόβαθρο: Η αιτιολογία της Πρώιμης Ωοθηκικής Ανεπάρκειας (ΠΩΑ) είναι πολυπαραγοντική και περιλαμβάνει γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Παρά ταύτα, 90% των περιπτώσεων ταξινομούνται ως ιδιοπαθείς. Μολονότι σε ~30% των ασθενών η ΠΩΑ έχει οικογενή κατανομή, μόνο σε ~7% των περιπτώσεων έχουν διαπιστωθεί μοριακές διαταραχές.Σκοπός της μελέτης: Η αναζήτηση μοριακών διαταραχών σε γονίδια που ενέχονται στην οντογένεση και τη λειτουργία της ωοθήκης και έχουν συσχετιστεί με συναφή παθολογία: FOXL2, BMP15, GDF9, FOXE1 και NOBOX. Υποθέσαμε ότι α) η εμφάνιση μοριακής διαταραχής θα ήταν συχνότερη σε άτομα με εκδηλώσεις ΠΩΑ σε νεαρή ηλικία και β) η αναζήτηση μοριακών διαφοροποιήσεων σε περισσότερα του ενός γονιδίου στο ίδιο πληθυσμιακό δείγμα, θα μπορούσε να αναδείξει συνύπαρξη διαφορετικών μοριακών διαταραχών στο ίδιο άτομο.Άτομα που μελετήθηκαν και Μέθοδοι: Σε 38 γυναίκες με κλινική εμφάνιση της ΠΩΑ σε μέση ηλικία 17.4 ± 6.6 έτη, έγινε πλήρης αλληλούχιση των κωδικοποιουσών περιοχών των γονιδίων FOXL2, FOXE1, BMP15, NOBOX και GDF9. Επιπρόσθετα, όπου υπήρχε ένδειξη πιθανής έλλειψης ή διπλασιασμού γονιδίων, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική MLPA. Πενήντα θήλεα άτομα από τον γενικό Ελληνικό πληθυσμό χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες για τα γονίδια FOXL2, BMP15 και NOBOX, ενώ για το γονίδιο FOXE1 χρησιμοποιήθηκαν 75 άτομα.Αξιολόγηση αποτελεσμάτων: Για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε η in silico ανάλυση, η ab initio τρισδιάστατη προτύπωση των πρωτεϊνών καθώς και η σύγκριση της συχνότητας των γενετικών διαφοροποιήσεων (variants) τόσο μεταξύ ασθενών και μαρτύρων της παρούσης μελέτης όσο και μεταξύ ασθενών και ατόμων του Ευρωπαϊκού πληθυσμιακού δείγματος 1000 Genome Project (1000 GP).Αποτελέσματα: Στο γονίδιο FOXL2, διαπιστώθηκε μία νέα (novel), de novo, ετερόζυγη απάλειψη (p.K150Rfs*121) σε μία ασθενή (2.6%). Στο γονίδιο FOXE1, διαπιστώθηκε αλυσίδα αλανινών με γονότυπο 8/16 σε δύο ασθενείς και 8/14 σε μία ασθενή, (φυσιολογικοί γονότυποι 14/14 ή 16/16). Η γενετική αυτή διαφοροποίηση αναφέρεται για πρώτη φορά (novel) στη βιβλιογραφία. Σε τρεις επιπλέον ασθενείς ανιχνεύθηκε αλυσίδα αλανινών με γονότυπους 12/16, 15/16 και 14/17, αντίστοιχα. Ο γονότυπος 15/16 επίσης δεν έχει αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία. Στην ομάδα των μαρτύρων διαπιστώθηκε διαφοροποιημένη αλυσίδα αλανινών με γονότυπο 8/14 σε ένα μόνο άτομο. Στο γονίδιο BMP15, διαπιστώθηκε η μετάλλαξη p.Q115H σε ετεροζυγωτία σε μία ασθενή (2.6%) και σε καμία από τις μάρτυρες της παρούσας μελέτης ή του πληθυσμιακού δείγματος του 1000 GP. Επιπρόσθετα, η in silico ανάλυση της p.Q115H έδειξε ότι είναι επιβλαβής σε 5/8 προγράμματα που χρησιμοποιήθηκαν. Στο γονίδιο BMP15 διαπιστώθηκε επίσης η γενετική διαφοροποίηση p.A180T σε ετερόζυγη μορφή σε 2.6% των ασθενών, 0% στις μάρτυρες και 0.5% στο πληθυσμιακό δείγμα του 1000 GP. Η in silico ανάλυση της p.A180T έδειξε ότι είναι επιβλαβής μόνο σε 2/8 προγράμματα. Εντούτοις, η μετάλλαξη p.A180T προκαλεί σημαντική τροποποίηση του πρωτεϊνικού προτύπου της αντίστοιχης BMP15 πρωτεΐνης. Ο γονότυπος c.-9C>G + p.N103S του γονιδίου BMP15 διαπιστώθηκε σε ομοζυγωτία σε 5.2% των γυναικών με ΠΩΑ έναντι 0% στις μάρτυρες και 0.5% στο πληθυσμιακό δείγμα του 1000 GP (p:0.075). Στο γονίδιο NOBOX διαπιστώθηκαν γενετικές διαφοροποιήσεις που χαρακτηρίστηκαν ως πολυμορφισμοί. Δεν διαπιστώθηκε παρερμηνεύσιμη γενετική διαφοροποίηση στο γονίδιο GDF9. Σε πέντε ασθενείς διαπιστώθηκε ύπαρξη γενετικών διαφοροποιήσεων σχετικών με τον κλινικό φαινότυπο της ΠΩΑ σε περισσότερα του ενός γονιδίου στο ίδιο άτομο.Συμπέρασμα: Γενετικές διαφοροποιήσεις (variants) που πιθανότατα σχετίζονται με τον κλινικό φαινότυπο της ΠΩΑ διαπιστώθηκαν σε 44.7% των ασθενών που μελετήθηκαν. Η αυξημένη συχνότητα γενετικών διαφοροποιήσεων στο πληθυσμιακό μας δείγμα σε σχέση με τα βιβλιογραφικά δεδομένα (~7%) πρέπει να αποδοθεί α) στην μελέτη πολλαπλών γονιδίων και β) στην αναζήτησή τους σε άτομα με εκδήλωση της ΠΩΑ σε νεαρή ηλικία. Η ύπαρξη γενετικών διαφοροποιήσεων σε δύο γονίδια σε πέντε ασθενείς, πιθανώς υποδηλώνει ότι η διγονική κληρονομικότητα ενέχεται στην εκδήλωση της ΠΩΑ, φαινόμενο που έχει παρατηρηθεί και σε άλλες νοσολογικές οντότητες. Η έγκαιρη αναγνώριση γονιδιακής διαταραχής σε άτομα με ΠΩΑ δεν έχει μόνο θεωρητικό αλλά και πρακτικό ενδιαφέρον. Η ακριβής αιτιολόγηση της ΠΩΑ μπορεί να καθορίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια την πρόγνωση, να δώσει δυνατότητα γενετικής συμβουλευτικής και να συμβάλλει στην αντιμετώπιση της αναμενόμενης υπογονιμότητας με κατάψυξη και συντήρηση ωαρίων (cryopreservation)

PRKACB variants in skeletal disease or adrenocortical hyperplasia: effects on protein kinase A

Genetic variants in components of the protein kinase A (PKA) enzyme have been associated with various defects and neoplasms in the context of Carney complex (CNC) and in isolated cases, such as in primary pigmented nodular adrenocortical disease (PPNAD), cortisol-producing adrenal adenomas (CPAs), and various cancers. PRKAR1A mutations have been found in subjects with impaired cAMP-dependent signaling and skeletal defects; bone tumors also develop in both humans and mice with Prkar1a abnormalities. We studied the PRKACB gene in 148 subjects with PPNAD and related disorders, who did not have other PKA-related defects and identified two subjects with possibly pathogenic PRKACB gene variants and unusual bone and endocrine phenotypes. The first presented with bone and other abnormalities, and carried a de novo c.858_860GAA (p.K286del) variant. The second subject carried the c.899 C>T (p.T300M) variant and had a PPNAD-like phenotype. Both variants are highly conserved in the PRKACB gene. In functional studies, the p.K286del variant affected PRKACB protein stability and led to increased PKA signaling. The p.T300M variant did not affect protein stability or response to cAMP and its pathogenicity remains uncertain. We conclude that PRKACB germline variants are uncommon but may be associated with phenotypes that resemble those of other PKA-related defects. However, detailed investigation of each variant is needed as PRKACB appears to be only rarely affected in these conditions, and variants such as p.T300M maybe proven to be clinically insignificant, whereas others (such as p.K286del) are clearly pathogenic and may lead to a novel skeletal syndrome phenotype

Variants in PRKAR1B cause a neurodevelopmental disorder with autism spectrum disorder, apraxia, and insensitivity to pain.

PurposeWe characterize the clinical and molecular phenotypes of six unrelated individuals with intellectual disability and autism spectrum disorder who carry heterozygous missense variants of the PRKAR1B gene, which encodes the R1β subunit of the cyclic AMP-dependent protein kinase A (PKA).MethodsVariants of PRKAR1B were identified by single- or trio-exome analysis. We contacted the families and physicians of the six individuals to collect phenotypic information, performed in vitro analyses of the identified PRKAR1B-variants, and investigated PRKAR1B expression during embryonic development.ResultsRecent studies of large patient cohorts with neurodevelopmental disorders found significant enrichment of de novo missense variants in PRKAR1B. In our cohort, de novo origin of the PRKAR1B variants could be confirmed in five of six individuals, and four carried the same heterozygous de novo variant c.1003C>T (p.Arg335Trp; NM_001164760). Global developmental delay, autism spectrum disorder, and apraxia/dyspraxia have been reported in all six, and reduced pain sensitivity was found in three individuals carrying the c.1003C>T variant. PRKAR1B expression in the brain was demonstrated during human embryonal development. Additionally, in vitro analyses revealed altered basal PKA activity in cells transfected with variant-harboring PRKAR1B expression constructs.ConclusionOur study provides strong evidence for a PRKAR1B-related neurodevelopmental disorder

Variants in PRKAR1B cause a neurodevelopmental disorder with autism spectrum disorder, apraxia, and insensitivity to pain

Purpose We characterize the clinical and molecular phenotypes of six unrelated individuals with intellectual disability and autism spectrum disorder who carry heterozygous missense variants of the PRKAR1B gene, which encodes the R1 beta subunit of the cyclic AMP-dependent protein kinase A (PKA). Methods Variants of PRKAR1B were identified by single- or trio-exome analysis. We contacted the families and physicians of the six individuals to collect phenotypic information, performed in vitro analyses of the identified PRKAR1B-variants, and investigated PRKAR1B expression during embryonic development. Results Recent studies of large patient cohorts with neurodevelopmental disorders found significant enrichment of de novo missense variants in PRKAR1B. In our cohort, de novo origin of the PRKAR1B variants could be confirmed in five of six individuals, and four carried the same heterozygous de novo variant c.1003C>T (p.Arg335Trp; NM_001164760). Global developmental delay, autism spectrum disorder, and apraxia/dyspraxia have been reported in all six, and reduced pain sensitivity was found in three individuals carrying the c.1003C>T variant. PRKAR1B expression in the brain was demonstrated during human embryonal development. Additionally, in vitro analyses revealed altered basal PKA activity in cells transfected with variant-harboring PRKAR1B expression constructs. Conclusion Our study provides strong evidence for a PRKAR1B-related neurodevelopmental disorder