Regulation de la glycose chez Escherichia coli: Obtention et etude de mutants de la phosphofructokinase 1

SIGLEINIST T 70633 / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc

Recombinaison specifique de site chez les archaea. Implication dans le cycle du virus SSV1 de Sulfolobus shibatae

L'étude des virus d'archaea, la manière dont ils sont capables d'infecter leurs hôtes et éventuellement de réaliser le transfert de certains gènes est d'intérêt pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui ont permis le brassage de l'information génétique dans le phylum des archaea. Notre modèle d'étude est le fusellovirus SSV1 qui infecte certaines souches du genre Sulfolobus, dont Sulfolobus shibatae et Sulfolobus solfataricus. Le cycle viral de SSV1 est actuellement très peu connu, mais comprend l'intégration du génome viral dans celui de l'hôte à un site spécifique et la production de particules virales, sans lyse cellulaire, lors d'irradiation UV des cultures infectées. Nous avons initié l'étude de ce virus en analysant les propriétés biochimiques de son intégrase. Nous avons ainsi montré que l'intégrase virale était un membre à part entière de la famille des tyrosine recombinases, une classe de recombinases spécifiques de site que l'on trouve chez les procaryotes eubactériens mais également chez les eucaryotes. L'étude biochimique de l'intégrase de SSV1 nous a permis de mettre en évidence le caractère hybride du mécanisme de recombinaison spécifique de site chez les archaea. En effet, si l'organisation des sites de recombinaison est similaire à celle de systèmes phagiques eubactériens, celle du site actif de la recombinase est de type eucaryote, puisqu'il est assemblé à l'interface de deux protomères fournissant chacun des résidus intervenant dans la catalyse. Nous continuerons l'étude de l'organisation spatiale de ce système mosaïque en cristallisant l'intégrase sur un site synthétique. Une autre originalité du système archaéen est que le gène de l'intégrase est disrupté lors de l'intégration du génome viral dans celui de son hôte. Cette particularité, conservée chez tous les fusellovirus séquencés à ce jour, ouvre de nombreuses hypothèses quant au rôle de la recombinaison spécifique de site dans leur cycle réplicatif. La compréhension du mode de réplication, du maintien et de la mobilisation de ces virus lors de signaux environnementaux tels que l'irradiation UV est essentielle non seulement pour évaluer leur rôle dans la plasticité des génomes d'archaea, mais également pour leur utilisation future comme outils génétique chez leurs hôtes naturels, les Sulfolobales.Nous exploiterons les résultats obtenus in vitro pour évaluer le rôle de l'intégration dans le maintien du virus sous forme stable, en replaçant des mutations inactivant soit l'intégrase soit le site viral de recombinaison dans le génome de SSV1. Le devenir de ces virus recombinants réintroduits dans Sulfolobus solfataricus sera évalué et nous permettra de déterminer si l'intégration du génome viral dans celui de son hôte est essentiel au maintien et à l'amplification du virus. Une analyse biochimique réciproque consistera à déterminer si une forme tronquée de l'intégrase (correspondant au produit de la disruption intégrative) est fonctionnelle pour le processus d'excision. La directionalité des évènements d'intégration et d'excision peut reposer soit sur la forme active de la recombinase (tronquée ou non) soit, et de manière non exclusive, par l'intervention de protéines accessoires fournies soit par l'hôte soit par le virus. L'identification de ces partenaires éventuels sera réalisée en utilisant des approches biochimiques classiques (co-immunoprécipitation, affinité, séquence peptidique) dans différentes conditions de croissance induisant ou non la production virale. Les résultats seront confrontés aux informations obtenues par les analyses transcriptomiques des effets des radiations réalisées sur Sulfolobus mais également Thermococcus ou Pyrococcus. L'analyse du pool de gènes induits lors d'une irradiation devrait contribuer à l'identification des facteurs de l'hôte intervenant dans la production virale en réponse au stress.Outre le rôle de l'intégration dans le cycle viral, nous évaluerons dans une approche plus globale le rôle des différentes protéines codées par le virus. En effet, sur les 34 protéines potentiellement produites par SSV1 seules 4 ont une fonction identifiée. Par ailleurs, l'analyse comparative des différents génomes de fusellovirus montre que seules 18 ORFs (dont l'intégrase) sont communes à tous ces virus, suggérant que les protéines correspondantes assurent les fonctions minimales essentielles au développement viral. Chacune de ces ORFs sera délétée par LI-PCR. Cette stratégie devrait nous permettre de nous affranchir d'effets secondaires transcriptionnels liés à l'organisation polycistronique du génome viral. L'effet de l'inactivation de chaque ORF sera évalué en prenant en compte différentes étapes du développement viral (stabilité du génome dans la cellule hôte, production de particules virales, infectivité...). Nous espérons ainsi définir la fonction de ces protéines qui n'ont pour l'heure aucun homologue dans le vivant

Etude du cycle viral de SSV1, un virus d'archaea thermoacidophile

Les Archaea ont été identifiées en 1978 par Carl Woese, séparant le domaine du vivant en trois domaines distinct. Ces organismes ont principalement été isolés à partir d'environnements extrêmes (haute température, haute salinité ... ). A ce jour, une cinquantaine de virus d'archaea ont été identifiés, et ils présentent une grande variété de morphotypes. Les Fusellovirus, qui infectent les archaea thermoacidophile du genre Sulfolobus, sont parmi les plus étudiés. Les génomes de neuf Fusellovirus ont été séquencés jusqu'à présent, et treize CDS sont communes à l'ensemble de ces virus. Il a été prédit sur la base d'analyses in silico que l'une de ces treize CDS, B251, code un initiateur de réplication de type bactérien. Nous avons montré que B251 possède les caractéristiques d'un initiateur de réplication de type bactérien. Nous avons également identifié une protéine pouvant être impliquée dans l'initiation de la réplication des Fusellovirus. B129 est une protéine à doigt de zinc qui se fixe à la fois sur l'origine de réplication et à proximité du site de recombinaison attP, propriété similaire à celles d'IHF d'E. coli. En parallèle de ces analyses in vitro, nous avons étudié in silico l'organisation des génomes des Fusellovirus afin de localiser leur origine de réplication. Ces analyses nous ont permis de séparer les Fusellovirus en deux groupes se répliquant potentiellement selon des mécanismes différents. L'ensemble des résultats obtenus participe à une meilleure compréhension du cycle viral des Fusellovirus.ln 1978, Carl Woese identified a third domain of life, the Archaea. These organisms were first identified in extreme environmental conditions, such as high temperature and high salt concentration. There are about fifty archaeal viruses currently identified, and they have a large variety of morphotypes. Among these viruses, the Fuselloviruses are the best characterized. They infect members of the Sulfolobus genus, isolated from sulfurous hot springs. There are currently nine Fuselloviruses genomes sequenced, with thirteen CDS common to all these viruses. ln silico analysis predicted that one of these thirteen CDS, B251, could encode a bacterial-like replication initiator. We found that B251 have the characteristics of a bacterial-like replication initiator. We also identified a protein, which could be involved in replication initiation. B 129 is a zinc finger protein wich binds both to the origin of replication and close to the attP site, reminiscent of IHF in E. coli. We performed in silico analyses of the nine Fuselloviruses genomes to identify their replication origin. Using GC skew analyses, we found that the Fuselloviruses could be divided in two subgroups, each of which replicate their DNA in a different way. All these results help to understand how the Fuselloviruses replicate their DNA and will provide a better understanding of their life cycle.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Protective Role for H-NS Protein in IS1 Transposition

The transposase (InsAB′) of the insertion element IS1 can create breaks in DNA that lead to induction of the SOS response. We have used the SOS response to InsAB′ to screen for host mutations that affect InsAB′ function and thus point to host functions that contribute to the IS1 transposition mechanism. Mutations in the hns gene, which codes for a DNA binding protein with wide-ranging effects on gene expression, abolish the InsAB′-induced SOS response. They also reduce transposition, whether by simple insertion or cointegrate formation, at least 100-fold compared with the frequency seen in hns(+) cells. Examination of protein profiles revealed that in an hns-null mutant, InsAB′ is undetectable under conditions where it constitutes the most abundant protein in hns(+) cells. Likewise, brief labeling of the hns cells with [(35)S]methionine revealed very small amounts of InsAB′, and this was undetectable after a short chase. Transcription from the promoters used to express insAB′ was essentially unaltered in hns cells, as was the level of insAB′ mRNA. A mutation in lon, but not in ftsH or clpP, restored InsAB′ synthesis in the hns strain, and a mutation in ssrA partially restored it, implying that the absence of H-NS leads to a problem in completing translation of insAB′ mRNA and/or degradation of nascent InsAB′ protein

Origin and evolution of DNA topoisomerases.

The DNA topoisomerases are essential for DNA replication, transcription, recombination, as well as for chromosome compaction and segregation. They may have appeared early during the formation of the modern DNA world. Several families and subfamilies of the two types of DNA topoisomerases (I and II) have been described in the three cellular domains of life (Archaea, Bacteria and Eukarya), as well as in viruses infecting eukaryotes or bacteria. The main families of DNA topoisomerases, Topo IA, Topo IB, Topo IC (Topo V), Topo IIA and Topo IIB (Topo VI) are not homologous, indicating that they originated independently. However, some of them share homologous modules or subunits that were probably recruited independently to produce different topoisomerase activities. The puzzling phylogenetic distribution of the various DNA topoisomerase families and subfamilies cannot be easily reconciled with the classical models of early evolution describing the relationships between the three cellular domains. A possible scenario is based on a Last Universal Common Ancestor (LUCA) with a RNA genome (i.e. without the need for DNA topoisomerases). Different families of DNA topoisomerases (some of them possibly of viral origin) would then have been independently introduced in the different cellular domains. We review here the main characteristics of the different families and subfamilies of DNA topoisomerases in a historical and evolutionary perspective, with the hope to stimulate further works and discussions on the origin and evolution of these fascinating enzymes

Convergences nationales, dimensions partisanes et affinités croisés

De La Serre Françoise, Smouts Marie-Claude, Bibes Geneviève, Ménudier Henri. Convergences nationales, dimensions partisanes et affinités croisés. In: Revue française de science politique, 29ᵉ année, n°6, 1979. pp. 1014-1046