A Novel 3-Methyladenine DNA Glycosylase from Helicobacter pylori Defines a New Class within the Endonuclease III Family of Base Excision Repair Glycosylases

The cloning, purification, and characterization of MagIII, a 3-methyladenine DNA glycosylase from Helicobacter pylori, is presented in this paper. Sequence analysis of the genome of this pathogen failed to identify open reading frames potentially coding for proteins with a 3-methyladenine DNA glycosylase activity. The putative product of the HP602 open reading frame, reported as an endonuclease III, shares extensive amino acid sequence homology with some bacterial members of this family and has the canonic active site helix-hairpin-helix-GPD motif. Surprisingly, this predicted H. pylori endonuclease III encodes a 25,220-Da protein able to release 3-methyladenine, but not oxidized bases, from modified DNA. MagIII has no abasic site lyase activity and displays the substrate specificity of the 3-methyladenine-DNA glycosylase type I of Escherichia coli (Tag) because it is not able to recognize 7-methylguanine or hypoxanthine as substrates. The expression of the magIII open reading frame in null 3-methyladenine glycosylase E. coli (tag alkA) restores to this mutant partial resistance to alkylating agents. MagIII-deficient H. pylori cells show an alkylation-sensitive phenotype. H. pylori wild type cells exposed to alkylating agents present an adaptive response by inducing the expression of magIII. MagIII is thus a novel bacterial member of the endonuclease III family, which displays biochemical properties not described for any of the members of this group until now.Fil: O'Rourke, Eyleen J.. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Chevalier, Catherine. Instituto Pasteur; FranciaFil: Boiteux, Serge. Centre National de la Recherche Scientifique; FranciaFil: Labigne, Agnès. Instituto Pasteur; FranciaFil: Ielpi, Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Radicella, Juan Pablo. Centre National de la Recherche Scientifique; Franci

dUTPase activity is critical to maintain genetic stability in Saccharomyces cerevisiae

We identified a viable allele (dut1-1) of the DUT1 gene that encodes the dUTPase activity in Saccharomyces cerevisiae. The Dut1-1 protein possesses a single amino acid substitution (Gly82Ser) in a conserved motif nearby the active site and exhibits a greatly reduced dUTPase activity. The dut1-1 single mutant exhibits growth delay and cell cycle abnormalities and shows a strong spontaneous mutator phenotype. All phenotypes of the dut1-1 mutant are suppressed by the simultaneous inactivation of the uracil DNA N-glycosylase, Ung1. However, the ung1 dut1-1 double mutant accumulates uracil in its genomic DNA. The viability of the dut1-1 mutant is greatly impaired by the simultaneous inactivation of AP endonucleases. These data strongly suggest that the phenotypes of the dut1-1 mutant result from the incorporation of dUMPs into DNA subsequently converted into AP sites. The analysis of the dut1-1 strain mutation spectrum showed that cytosines are preferentially incorporated in front of AP sites in a Rev3-dependent manner during translesion synthesis. These results point to a critical role of the Dut1 protein in the maintenance of the genetic stability. Therefore, the normal cellular metabolism, and not only its byproducts, is an important source of endogenous DNA damage and genetic instability in eukaryotic cells

REPARATION DES BASES OXYDEES CHEZ LES EUCARYOTES (LA PROTEINE YOGG1 DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE MECANISMES D'ACTION ET SPECIFICITE DE SUBSTRAT)

LES ESPECES REACTIVES DE L'OXYGENE D'ORIGINE ENDOGENE OU EXOGENE, SONT SUSCEPTIBLES D'ENDOMMAGER LA MOLECULE D'ADN. SI CES ALTERATIONS NE SONT PAS ELIMINEES, LEUR PRESENCE DANS L'ADN EST POTENTIELLEMENT MUTAGENE ET/OU LETALE POUR LA CELLULE. LA LESION OXYDATIVE LA PLUS FREQUEMMENT GENEREE EST LA 7,8-DIHYDRO-8-OXOGUANINE (8-OXOG). LA PRINCIPALE VOIE D'ELIMINATION DES BASES OXYDEES EST LA REPARATION PAR EXCISION DE BASES DONT L'ETAPE INITIALE EST ASSUREE PAR UNE CLASSE SPECIFIQUE D'ENZYMES : LES ADN GLYCOSYLASES. CHEZ ESCHERICHIA COLI, DEUX ADN GLYCOSYLASES FPG ET MUTY COOPERENT POUR ELIMINER LA 8-OXOG DE L'ADN. LES MUTANTS BACTERIENS DEFICIENTS POUR CES PROTEINES (FPG MUTY) ACCUMULENT DES TRANSVERSIONS G:C -> T:A. LA COMPLEMENTATION FONCTIONNELLE DU PHENOTYPE HYPER MUTATEUR DE LA SOUCHE FPG MUTY, PAR UNE BANQUE D'ADN GENOMIQUE DE LEVURE, A PERMIS D'IDENTIFIER LA PREMIERE ADN GLYCOSYLASE EUCARYOTE RESPONSABLE DE L'ELIMINATION DE LA 8-OXOG : LA PROTEINE YOGG1 (8-OXOGUANINE ADN GLYCOSYLASE) DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, HOMOLOGUE FONCTIONNEL DES FPG BACTERIENS. CES PRESENTS TRAVAUX RAPPORTENT LA PURIFICATION ET LA CARACTERISATION DES PROPRIETES CATALYTIQUES DE LA PROTEINE YOGG1. C'EST UNE ADN GLYCOSYLASE/ AP LYASE QUI RECONNAIT ET EXCISE DE L'ADN LA 8-OXOG ET LES RESIDUS DE FAPYG. L'EMPREINTE AUX OH O DE YOGG1 SUR UN ADN MODIFIE, INDIQUE QUE LA PROTEINE INTERAGIT FORTEMENT AVEC LE BRIN CONTENANT LA LESION. LA MUTAGENESE DIRIGEE DE LA LYSINE 241 ET DE L'ACIDE ASPARTIQUE 260, MONTRE QUE CES RESIDUS SONT INDISPENSABLES AUX ACTIVITES CATALYTIQUES. LA SEQUENCE DU GENE OGG1 A PERMIS D'ISOLER DES HOMOLOGUES DE LA PROTEINE YOGG1 CHEZ LES ORGANISMES EUCARYOTES SUPERIEURS. AFIN DE DEFINIR DES DOMAINES FONCTIONNELS, D'AUTRES FORMES MUTEES DE YOGG1 ONT ETE ETUDIES. LE HAUT NIVEAU DE CONSERVATION DES SEQUENCES AINSI QUE DES DIFFERENTES PROPRIETES DES OGG1 EUCARYOTES FONT DE LA PROTEINE DE LEVURE UN MODELE D'ETUDE DES MECANISMES DE REPARATION DES BASES OXYDEES IN VITRO ET IN VIVO.PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocCentre Technique Livre Ens. Sup. (774682301) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Protection de l'intégrité des télomères chez la levure

Les télomères sont les complexes nucléoprotéiques des extrémités des chromosomes linéaires. Ils ont notamment pour fonction de maintenir l'intégrité du génome en protégeant les extrémités chromosomiques contre les fusions. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, la protéine Rap1 est le facteur liant à haute densité les séquences télomériques. Dans cette étude, nous utilisons un nouvel allèle nul conditionnel de RAP1 et nous montrons que la perte de Rap1 provoque des fusions télomère-télomère, détectées par PCR. Un grand nombre de ces fusions a été cloné et le point de fusion a été analysé par restriction. Cette analyse montre que les fusions impliquent des télomères de taille sauvage. Ces fusions ne sont pas détectées dans les cellules déficientes pour l'un des facteurs du " Non-Homologous End-Joining " (NHEJ), incluant les protéines des complexes de la ligase IV (Lig4, Lif1, Lif2), KU (Yku70, Yku80) et Mre11 (Mre11, Rad50, Xrs2). Tous ces résultats tendent à démontrer que Rap1 est essentiel pour bloquer les événements de NHEJ entre télomères. Rap1 étant un facteur télomérique conservé à travers l'évolution, il est fort probable que le rôle de Rap1 dans la protection des télomères contre le NHEJ soit universel.Fusions between chromosomes would compromise genome integrity. In particular, Non-Homologous End Joining (NHEJ) must be excluded from telomeres. Rap1p is the prominent telomere binding-factor in Saccharomyces cerevisiae and homologues are found in human cells and Schyzosaccharomyces pombe. Instead of binding directly the telomeric repeats, spRap1 and hRap1 are recruited by the major telomere binding-factor in these organisms, Taz1 and TRF2, respectively. It has been demonstrated that Taz1 and TRF2 protect chromosomes against end fusions by NHEJ.We took advantage in this study of a new conditional allele of RAP1, rap1-( ), to test a role for Rap1p in telomere protection. In this allele, Rap1p is lost when cells progress toward stationary phase. This loss correlated with the appearance of end-to-end fusions detected by PCR. Telomere fusions were cloned. The fusion point seems difficult to sequence. However, the presence of a restriction site at the junction of some cloned fusions allowed us to determine that fusions occurred between telomeres of near wild-type length. Furthermore, we observed that the sequence at the fusion point seems random. Telomere fusions were not observed in rap1-( ) cells defective for each factor required for NHEJ in budding yeast: Lig4p, Lif1p, Lif2p, Yku70p, Yku80p, Mre11p, Rad50p, and Xrs2p. The NHEJ-DNA polymerase Pol4p is also required. Sae2p and Tel1p, two known regulators of the Mre11p-Rad50p-Xrs2p complex not required for NHEJ, did not seem to be involved in telomere fusions.Thus, Rap1p protects telomeres from NHEJ. This newly described role is likely to be conserved.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Rôle de la topoisomérase 1 et de la réparation des mésappariements (MMR) dans la mutagénèse associée à la transcription chez Saccharomyces cerevisiae

La mutagenèse spontanée est un phénomène complexe, à la fois dangereux pour la qualité de l information génétique et moteur pour l évolution. Nos études ont montré qu une activation importante de la transcription du gène CAN1 s accompagne d une augmentation ciblée de la mutagenèse spontanée à ce locus chez la levure S. cerevisiae. L analyse moléculaire des mutations CanR montre que la transcription stimule les substitutions de bases et les insertions/délétions. Les substitutions de bases et les insertions/délétions (-1/+1) dépendent de la DNA polymérase zeta et semblent refléter une stimulation du processus de mutagenèse spontanée observé dans un contexte sauvage. D autre part les mutations (-2/-3) constituent une signature de la mutagenèse associée à la transcription. Nos résultats suggèrent que la transcription favorise le blocage des topoisomérases 1 sur l ADN, dont la réparation est à l origine de ces mutations (-2/-3). Cette étude révèle les conflits inévitables entre Top1 et la transcription, et leur impact sur la stabilité du génome. Par ailleurs, l inactivation de la voie de réparation des mésappariements induit une forte augmentation de la mutagénèse associée à la transcription. Ces mésappariements semblent refléter une diminution dans la fidélité de la synthèse d ADN au niveau des gènes transcrits. Le recrutement du MMR sur les régions transcrites observées sur l ensemble du génome de S.cerevisiae, indique que la fidélité de la réplication n est pas uniforme sur le génome et dépend, entre autres, du niveau de transcription.Spontaneous mutagenesis is a complex phenomenon, both dangerous for genome integrity and necessary for evolution. Our study showed that in S.cerevisiae, CAN1 transcription activation is associated with an increased spontaneous mutagenesis specifically on this locus. The molecular analysis of CanR mutations reveals that transcription stimulates base substitutions and insertions/deletions. Base substitutions and insertions/deletions of 1 nucleotide depend on DNA polymerase zeta and reflect most likely a stimulation of the spontaneous mutagenesis observed under wild type transcription. On the other hand, (-2/-3) mutations represent a signature of transcription associated mutagenesis. Our results suggest that transcription enhances topoisomerase 1 trapping on the DNA, which repair leads to (-2/-3) mutations. This study reveals unavoidable conflicts between Top1 and the transcriptional machinery and their potential impact on genome stability. In addition, mismatch repair inactivation induces a strong increase of transcription associated mutagenesis. These mismatches seem to reflect a decrease of DNA synthesis fidelity on the transcribed gene. The recruitment of MMR on transcribed regions is observed on the whole genome of S.cerevisiae, indicating that replication fidelity is not uniform and depends partly on the level of transcription.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Rôle biologique des ADN glycosylases Ogg1, Ntg1, Ntg2 et leurs inter-relations avec les différents systèmes de réparation de l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae

PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF

Caractéristisation de formes mutantes et polymorphes du gène de réparation de l'ADN hOGG1 dans des tumeurs humaines

PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF

Endogenous DNA abasic sites cause cell death in the absence of Apn1, Apn2 and Rad1/Rad10 in Saccharomyces cerevisiae

In Saccharomyces cerevisiae, mutations in APN1, APN2 and either RAD1 or RAD10 genes are synthetic lethal. In fact, apn1 apn2 rad1 triple mutants can form microcolonies of ∼300 cells. Expression of Nfo, the bacterial homologue of Apn1, suppresses the lethality. Turning off the expression of Nfo induces G(2)/M cell cycle arrest in an apn1 apn2 rad1 triple mutant. The activation of this checkpoint is RAD9 dependent and allows residual DNA repair. The Mus81/Mms4 complex was identified as one of these back-up repair activities. Furthermore, inactivation of Ntg1, Ntg2 and Ogg1 DNA N-glycosylase/AP lyases in the apn1 apn2 rad1 background delayed lethality, allowing the formation of minicolonies of ∼10(5) cells. These results demonstrate that, under physiological conditions, endogenous DNA damage causes death in cells deficient in Apn1, Apn2 and Rad1/Rad10 proteins. We propose a model in which endogenous DNA abasic sites are converted into 3′-blocked single-strand breaks (SSBs) by DNA N-glycosylases/AP lyases. Therefore, we suggest that the essential and overlapping function of Apn1, Apn2, Rad1/Rad10 and Mus81/Mms4 is to repair 3′-blocked SSBs using their 3′-phosphodiesterase activity or their 3′-flap endonuclease activity, respectively