Production of recombinant carbohydrate-binding modules in Pichia pastoris and their application in the modification of paper fibers

Dissertação de mestrado em BioengenhariaEnzymes have been widely applied in the paper industry for the modification of pulp and paper properties. Although they have the potential to replace hazardous chemicals, their use in the hydrolysis of polysaccharides reduces both fiber strength and mass. To overcome these negative effects, the potential use of recombinant carbohydrate-binding modules (CBMs) in papermaking, has been receiving growing attention. A CBM is defined as a contiguous amino-acid sequence within a carbohydrate-active enzyme, presenting an independent fold and function, and carbohydrate-binding activity. In addition, glycosylation in fungal CBMs has been suggested to be important for the modification of pulp and paper properties In order to improve cellulose fibers from the paper industry using an enzyme-free process, consisting of recombinant CBMs, we aimed to: (1) clone and produce in Pichia pastoris recombinant CBM1 from Trichoderma reesei (fungus) and CBM3 from Clostridium thermocellum (bacteria), (2) optimize the production and purification of the recombinant CBMs by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) and (3) characterize the cellulose-binding capacity of the recombinant CBMs and study their effects in the properties of pulp (drainability) and paper fibers (wetability, bursting and tensile strengths, lengthening, tearing and air permeability). Recombinant CBM1 fused to enhanced green fluorescent protein (eGFP), directly or by the native glycosylated CBM linker, was produced at high levels but mainly as intracellular protein. Their purification from P. pastoris cell-free extracts by IMAC resulted in low amounts, which compromised their characterization and application. Nevertheless, the two purified recombinant CBM-fusions were able to bind to cellulose. On the other hand, both recombinant versions of CBM3, glycosylated and non-glycosylated, were produced as secreted proteins with the nonglycosylated CBM3 exhibiting higher cellulose-binding affinity than the glycosylated version. Regardless of the lack of effect on pulp drainability, both CBM3 versions improved significantly the mechanical properties of Eucaliptus globulus papersheets, namely the burst and tensile strength indexes, up to 12% and 10% (in papersheets made of E. globulus pulp treated with nonglycosylated CBM3), respectively. In addition, non-glycosylated CBM3 decreased significantly the wetability and air permeability of papersheets. However, both recombinant CBM3 versions did not have any effect on papersheets made of a mixture of E. globulus and Pinus sylvestris (30:70) pulp. The modification of paper fibers by recombinant CBM3 was dependent on its concentration but not on its glycosylation. These results indicate that recombinant CBM3 play an important role in the improvement of surface/interface properties of cellulose fibers, contributing to paper products with higher quality.As enzimas têm sido amplamente aplicadas na indústria de papel para a modificação das propriedades de pasta e papel. Embora tenham o potencial para substituir produtos químicos perigosos, a sua utilização na hidrólise de polissacarídeos reduz a massa e a resistência das fibras. De forma a ultrapassar estes efeitos negativos, tem-se dado cada vez mais atenção à potencial utilização de módulos recombinantes de ligação a carbohidratos (CBMs) no fabrico de papel. Um CBM é definido como uma sequência de aminoácidos de uma enzima, que apresenta uma estrutura e função independentes, bem como atividade de ligação a carbohidratos. Além disso, a glicosilação dos CBMs de origem fúngica tem sido sugerida como importante para a modificação das propriedades da pasta e do papel. De forma a melhorar as fibras de celulose da indústria de papel, utilizando um processo sem enzimas, e que consiste na utilização de CBMs recombinantes, propusemo-nos a: (1) clonar e produzir em Pichia pastoris o CBM1 recombinante de Trichoderma reesei (fungo) e o CBM3 de Clostridium thermocellum (bactéria), (2) optimizar a produção e purificação dos CBMs recombinantes por cromatografia de afinidade com iões metálicos imobilizados (IMAC) e (3) caraterizar a capacidade de ligação à celulose dos CBMs recombinantes e estudar os seus efeitos nas propriedades de pasta (drenabilidade) e fibras de papel (molhabilidade, rutura, resistência à tração, alongamento, rasgamento e permeabilidade ao ar). O CBM1 recombinante fundido com a proteína verde fluorescente (eGFP), diretamente ou através do linker glicosilado nativo do CBM, foi produzido em níveis elevados, mas sobretudo de forma intracelular. A sua purificação a partir de extratos celulares de P. pastoris por IMAC resultou em baixas quantidades, o que comprometeu a sua caraterização e aplicação. No entanto, as proteínas de fusão eGFP-CBM purificadas apresentaram capacidade de ligação à celulose. Por outro lado, ambas as versões recombinantes do CBM3 foram produzidas em grande quantidade no meio de cultura, tendo a versão não glicosilada apresentado uma maior afinidade de ligação à celulose. Independentemente de não terem alterado a drenabilidade de pastas de papel, ambas as versões recombinantes do CBM3 melhoraram significativamente as propriedades mecânicas das folhas de papel de Eucaliptus globulus, nomeadamente, os índices de rutura e de resistência à tração, até 12% e 10% (em folhas de papel feitas a partir de pasta E. globulus tratada com a versão não glicosilada do CBM3), respetivamente. Além disso, a versão não glicosilada do CBM3 diminuiu significativamente a molhabilidade e permeabilidade ao ar das folhas de papel. Contudo, ambas as versões recombinantes do CBM3 não provocaram qualquer efeito em folhas de papel feitas a partir de pasta E. globulus e Pinus sylvestris (30:70). A modificação das fibras de papel pelo CBM3 recombinante foi dependente da sua concentração, mas não da sua glicosilação. Estes resultados indicam que o CBM3 recombinante desempenha um papel importante na melhoria das propriedades superficiais/interfaciais de fibras de celulose, contribuindo para produtos de papel com maior qualidade.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) - Project GlycoCBMs PTDC/AGR-FOR/3090/2012 – FCOMP-01-0124-FEDER-02794

Modification of paper properties using carbohydrate-binding module 3 from the Clostridium thermocellum CipA scaffolding protein produced in Pichia pastoris: elucidation of the glycosylation effect

The carbohydrate-binding modules (CBMs) have emerged as an interesting alternative to enzymes for fibers modification, e.g. of pulp and paper. Glycosylation in CBMs is thought to have a key role in the improvement of cellulose fibers. Thus, in this work the non-glycosylated (CBM3mt) and glycosylated (CBM3wt) recombinant versions of CBM3 from Clostridium thermocellum CipAboth produced in Pichia pastoriswere studied. Binding assays showed that CBM3mt had a higher affinity for microcrystalline cellulose (Avicel) than CBM3wt. In addition, CBM3mt produced a much higher hydrophobization of Whatman paper than CBM3wt. However, the effects of the two CBM3s on pulp and paper were identical. The CBM3s did not affect the drainability of Eucalyptus globulus or a mixture of E. globulus and Pinus sylvestris pulps. On the other hand, both improved significantly strength-related properties of E. globulus papersheets, namely burst (up to 12 %) and tensile strength (up to 10 %) indexes. This is the first report showing the capacity of CBM3 from C. termocellum CipA to modify paper properties. The results showed that glycosylation did not influence the drainage of CBM3-treated pulps nor the properties of the produced papers. Thus, glycans in glycosylated CBM3 may not be related with fiber improvement, namely superior pulp drainage.C. Oliveira acknowledges support from Fundacao para a Ciencia e a Tecnologia (FCT), Portugal (Grant SFRH/BDP/63831/2009). The authors thank the FCT GlycoCBMs Project REF. PTDC/AGR-FOR/3090/2012-FCOMP-01-0124-FEDER-027948, the FCT Strategic Project PEst-OE/EQB/LA0023/2013, and the Project "BioInd-Biotechnology and Bioengineering for improved Industrial and Agro-Food processes", REF. NORTE-07-0124-FEDER-000028 Co-funded by the Programa Operacional Regional do Norte (ON.2-O Novo Norte), QREN, FEDER

Biocenoses de eucariotas em leitos de plantas para tratamento de águas residuais

Os Leitos de Plantas ou Leitos de Macrófitas constituem o tratamento secundário de água residual, dos sistemas de baixa tecnologia conhecidos por FitoETARs. Em casos concretos, as FitoETARs apresentam vantagens relevantes em relação aos sistemas de tratamento de águas residuais mais conhecidos. Com vista ao estudo das biocenoses rizosféricas de uma FitoETAR localizada na Unidade de Turismo de Habitação do Paço de Calheiros (concelho de Ponte de Lima), análises microbiológicas de amostras de água e análises microscópicas de amostras de substrato e raízes do leito foram acompanhadas pela monitorização de parâmetros físico-químicos e bioquímicos, tais como temperatura, pH, Carência Bioquímica de Oxigénio (CBO5) e Carência Química de Oxigénio (CQO). A eficiência de remoção da CBO5 e da CQO foi em média de 96% e 92%, respetivamente. Nas amostras analisadas ao microscópio observaram-se alguns metazoários e foram identificados 20 taxa de protozoários, 15 dos quais ciliados. Foi também constatada uma certa variação espacial e temporal da densidade e diversidade dos eucariotas. Sendo já reconhecido o importante papel dos diferentes grupos funcionais de protozoários nos sistemas de lamas ativadas onde são utilizados como bioindicadores, a sua monitorização em FitoETARs adivinha-se muito vantajosa

Improving paper properties using Clostridium thermocellum CBM3 glycosylated by Pichia pastoris

The enhancement of the surface/interface properties of cellulose fibers by carbohydrate-binding modules (CBMs) has been shown in several works. Moreover, glycosylation in fungal CBMs has been suggested essential for the modification of paper pulps properties, by improving fiber hydration, but there are no studies on this subject. In this work, the CBM3 from Clostridium thermocellum CipA scaffolding protein was recombinantly produced in Pichia pastoris highly glycosylated to access the importance of the glycans on the properties of cellulose fibers. A non-glycosylated version of CBM3 was also produced in the same yeast to serve as control. Both recombinant CBMs were extracellularly produced in high amounts with the non-glycosylated version exhibiting higher cellulose-binding affinity than the glycosylated version. The two recombinant CBMs did not modify the drainability of Eucalyptus globulus pulp, while the non-glycosylated CBM increased significantly the hidrophobicity of cellulose fibers, an effect not observed with the glycosylated CBM. However, both recombinant CBMs were able to improve significantly the mechanical properties of E. globulus papersheets, namely the burst (up to 12%) and tensile strength (up to 10%) indexes, resulting in decreased air permeability. These results were dependent on the CBM concentration but not on its glycosylation. This work shows that glycosylated CBM3 can also modify the properties of cellulose fibers, contributing for paper products with higher quality, but the glycosylation pattern tested was not relevant for that effect