A utilização de estirpes de leveduras geneticamente modificadas em enologia

Este estudo foi apoiado pelos projectos ENOSAFE (n.º 762, Programa AGRO, medida 8), pelo Instuituto Nacional de Investigação Agrária e LeVini (POCI/AGR/56102/2004), Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal

L’utilizzo di ceppi modificati di saccharomyces cerevisiae in enologia

Trata-se de uma tradução do seguinte artigo D. Schuller e M. Casal. 2005. The use of genetically modified yeast in the wine industry. Applied Microbiology and Biotechnology 68, 292-304.Negli ultimi decenni, la scienza e la tecnologia degli alimenti hanno contribuito all’introduzione di nuovi prodotti per soddisfare le richieste nutrizionali, socio-economiche e di qualità. Con la moderna genetica molecolare, l’importanza industriale di Saccharomyces Cerevisiae è accresciuta ulteriormente. La richiesta di ceppi geneticamente modificati (GM) di S. cerevisiae per il biodiesel, l’industria delle bevande e del pane o per la produzione di prodotti biotecnologici (per esempio, enzimi, prodotti farmaceutici) continuerà a crescere in futuro. Negli ultimi anni, sono stati ottenuti numerosi ceppi enologici specializzati di S. cerevisiae , che presentavano diverse e nuove proprietà enologiche, in grado di soddisfare le richieste derivanti dalle moderne pratiche di vinificazione. La comprensione delle complessità del transcrittoma, proteoma e metaboloma darà un contributo decisivo alla conoscenza della composizione genetica dei ceppi commerciali enologici ed influenzerà il miglioramento genetico grazie all’ingegneria genetica. I progressi più importanti riguardanti le implicazioni dell’utilizzo di ceppi GM nell’industria enologica sono discussi in questo articolo. Vengono considerati diversi aspetti, incluse le strategie utilizzate per la costruzione di ceppi nel rispetto degli obblighi legislativi attuali, la valutazione dei rischi ambientali riguardanti i ceppi geneticamente modificati, i metodi per il rilevamento del DNA ricombinante e la proteine e le ragioni dell’atteggiamento negativo dei consumatori nell’utilizzo di tali ceppi.Ringraziamenti Questo studio è stato finanziato dai progetti ENOSAFE (No. 762, Programa AGRO, medida 8) Instituto Nacional de Investigação Agrária and LeVini (POCTI/AGR/56102/2004) Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT

The genetic structure of fermentative vineyard-associated Saccharomyces cerevisiae populations revealed by microsatellite analysis

Prova tipográfica (In Press)From the analysis of six polymorphic microsatellite loci performed in 361 Saccharomyces cerevisiae isolates 93 alleles were identified, being 52 of them described for the first time. All these isolates have a distinct mtDNA RFLP pattern. They are derived from a pool of 1620 isolates obtained from spontaneous fermentations of grapes collected in three vineyards of the Vinho Verde Region in Portugal, during the 2001 – 2003 harvest seasons. For all loci analyzed, observed heterozygosity was three to four times lower than the expected value supposing a Hardy-Weinberg equilibrium (random mating and no evolutionary mechanisms acting), indicating a clonal structure and strong populational substructuring. Genetic differences among S. cerevisiae populations were apparent mainly from gradations in allele frequencies rather than from distinctive “diagnostic” genotypes, and the accumulation of small allele-frequency differences across six loci allowed the identification of population structures. Genetic differentiation in the same vineyard in consecutive years was of the same order of magnitude as the differences verified among the diferent vineyards. Correlation of genetic differentiation with the distance between sampling points within a vineyard suggested a pattern of isolation-by-distance, where genetic divergence in a vineyard increased with size. The continuous use of commercial yeasts has a limited influence on the autochthonous fermentative yeast population collected from grapes and may just slightly change populational structures of strains isolated from sites very close to the winery where they have been used. The present work is the first large-scale approach using microsatellite typing allowing a very fine resolution of indigenous S. cerevisiae populations isolated from vineyards.This study was supported by the project ENOSAFE (Nº 762, Programa AGRO, medida 8), the programme POCI 2010 (project POCI/AGR/56771/2004) and the grant nº 657 C2 from the cooperation agreement between the Portuguese Institute for International Scientific and Technological Cooperation (ICCTI) and the French Embassy in Lisbon. We wish to thank Prof. Célia Pais and for helpful discussions during the preparation of this manuscript. Prof. Paula Sampaio is kindly thanked for assistance with statistical analysis. Magda Silva Graça is gratefully acknowledged for the operation of the DNA sequencer. We also appreciate the kind assistance of the enologists Rui Cunha, Anselmo Mendes, Euclides Rodrigues and José Domingues for facilitating sampling campaigns in the three vineyards

Utilisation de souches de levures génétiquement modifiées en œnologie

ENOSAFE (No. 762, Programa AGRO, medida 8).Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), l’Instituto Nacional de Investigação Agrária et LeVin - POCI/AGR/56102/2004

The use of genetically modified Saccharomyces cerevisiae strains in the wine industry

Prova tipográfica (In Press).During the last decades, science and food technology have contributed at an accelerated rate to the introduction of new products to satisfy nutritional, socio-economic and quality requirements. With the emergence of modern molecular genetics, the industrial importance of Saccharomyces cerevisiae, continuously extended. The demand for suitable genetically modified (GM) S. cerevisiae strains for the biofuel, bakery and beverage industries or for the production of biotechnological products (e.g. enzymes, pharmaceutical products) will be continuously growing in the future. Numerous specialized S. cerevisiae wine strains were obtained in the last years, possessing a wide range of optimized or novel oenological properties, capable to satisfy the demanding nature of modern winemaking practice. Unlocking the transcriptome, proteome and metabolome complexities contributes decisively to the knowledge about the genetic make-up of commercial yeast strains and will influence wine strain improvement by genetic engineering. The most relevant advances regarding the importance and implications of the use of genetically modified yeast strains in the wine industry are discussed in this Mini-Review, considering a variety of aspects such as the strategies used for the construction of the strains with respect to current legislation requirements, environmental risk evaluations concerning the deliberate release of genetically modified yeast strains, methods for the detection of recombinant DNA and protein that are currently under evaluation, and the reasons for the critical public perception towards the application of such strains.União Europeia - Fundo Social Europeu (FSE) - III Quadro Comunitário de Apoio (QCA III) - Programa Operacional Agricultura e Desenvolvimento Rural (AGRO) - EnoSafe Nº 762, medida 8.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Programa Operacional Ciência, Tecnologia, Inovação (POCTI) - POCTI/AGR/56102/2004.LeVini.Instituto Nacional de Investigação Agrária

Better yeast for better wine: Saccharomyces cerevisiae strains for winemaking

Apresentação efetuada nas I Jornadas de Bioquímica, Braga, 201

Genetic diversity and molecular characterization of Saccharomyces cerevisiae strains from winemaking environments

Tese de doutoramento em CiênciasThe principal aim of the present work is to assess the genetic diversity of fermenting Saccharomyces cerevisiae strains found in vineyards belonging to the Vinho Verde Region in order to create a strain collection representing the region’s biodiversity wealth as a basis for future strain selection and improvement programs. Validation of molecular techniques for accurate genotyping is an indispensable prerequisite for biogeographical surveys. Molecular typing methods (microsatellite analysis, restriction fragment length polymorphism of mitochondrial DNA (mtDNA RFLP), an optimized PCR-based interdelta method and electrophoretic karyotyping) revealed to be substantially equivalent concerning their discriminatory power among 23 commercial S. cerevisiae strains. A large-scale biogeographical survey was devised during the 2001-2003 harvest seasons, comprising three farms, with wineries close to the vineyards, belonging to different sub-regions of the Vinho Verde Region located in northwest Portugal. From 90 grape samples collected, 54 spontaneous fermentations were achieved. The 1620 S. cerevisiae isolates obtained were analyzed by mtDNA RFLP. A high biodiversity was evident by the obtention of 297 different profiles, whereas only 17 profiles showed a wider temporal and geographical distribution, characterized by a general pattern of sporadic presence, absence and reappearance. A representative strain of each profile was further analyzed in six microsatellite loci. Accumulation of small allele-frequency differences across six loci in groups of strains allowed the identification of populational structures. Correlation of genetic differentiation with the distance between sampling points suggested a pattern of isolation-by-distance, where genetic divergence increases with the size of a vineyard. Tracking commercial yeast strains that are used by the wineries since five to ten years revealed to be the adequate experimental model for the environmental risk evaluation associated with the use of genetically modified yeast strains in the wine industry. The presence of commercial yeast strains was evaluated among the 1620 isolates of the present survey. The results were analyzed including data from an identical study performed in three vineyards of the Languedoc Region (south France). Among the 3780 yeast strains identified after spontaneous fermentation, 296 had a genetic profile identical to that of commercial yeast strains. In samples taken at distances from wineries higher than 100 m, less than 2% of the fermentative microflora had a genetic profile identical to that of commercial yeast. In samples taken at very close proximity to the winery and to water rills, the proportion of commercial yeasts increased to 10-43%. The vast majority (94%) of commercial yeasts were found at a distance of between 10 and 200 m from the winery. Commercial strains, despite their intensive annual utilization, do not seem to implant in vineyards, and do not predominate over the indigenous flora, being their presence characterized by natural fluctuations of periodical appearance/dissappearance as autochthonous strains. The data show that dissemination of commercial yeast in the vineyard is limited to short distances and periods of times and largely favoured by the presence of water runoff. Among the 101 recovered natural isolates of strain Zymaflore VL1, three isolates were characterized by loss of heterozygosity (microsatellite analysis), but revealed the same DNA content as the original commercial strain. Wines produced in the Vinho Verde Region are characterized by a high volatile acidity. Gene JEN1 encodes for a monocarboxylate permease in S. cerevisiae, which is subject to glucose repression. As a first approach aiming at the obtention of a genetically modified yeast able to remove acetic acid from grape must, a strain expressing JEN1 in the presence of glucose was achieved.O presente trabalho teve como principal objectivo a avaliação da diversidade genética de estirpes fermentativas de Saccharomyces cerevisiae na Região dos Vinhos Verdes no sentido de estabelecer uma colecção de leveduras, que representa a biodiversidade da região, como recurso para futuros programas de selecção e melhoramento de estirpes enológicas. A validação de métodos moleculares para genotipagem é um pré-requisito essencial para estudos biogeográficos. Neste sentido, foi realizada a análise de 6 loci de microsatélites, dos perfis de restrição de DNA mitocondrial (mtDNA RFLP), cariotipagem e de um método optimizado baseado na amplificação de sequências interdelta num conjunto de 23 estirpes comerciais de S. cerevisiae. Os métodos revelaram idêntico poder de discriminação, tendo-se obtido 21 perfis distintos, embora a cariotipagem tenha permitido distinguir uma das 3 estirpes que não foram diferenciadas pelos outros métodos. Tendo em linha de conta a principal directriz enunciada para este trabalho de tese, foi realizado um estudo biogeográfico em larga escala, em três quintas pertencentes a sub-regiões da Região Demarcada dos Vinhos Verdes de 2001 a 2003, com a adega localizada nas proximidades da vinha. Recolheram-se 90 amostras de uva, 54 das quais iniciaram a fermentação espontânea, permitindo a obtenção de 1620 isolados de S. cerevisiae. A elevada biodiversidade de estirpes fermentativas foi demonstrada pela obtenção de 297 perfis de mtDNA RFLP, dos quais apenas 17 apresentaram maior distribuição geográfica e temporal. Uma estirpe representativa de cada um dos 297 perfis de mtDNA RFLP foi analisada em 6 loci de microsatélites. A acumulação de pequenas diferenças nas frequências alélicas no conjunto dos 6 loci permitiu a identificação de estruturas populacionais em grupos de estirpes das diferentes vinhas. A correlação entre a distância dos pontos de amostragem com a diferenciação genética sugere um padrão de isolamento por distância em função do tamanho da vinha. O rastreio de estirpes comerciais utilizadas consecutivamente nos últimos 5 a 10 anos nas adegas acima mencionadas, constituiu um modelo experimental adequado para a avaliação de riscos ambientais associados ao uso de leveduras geneticamente modificadas na produção de vinhos. A presença de estirpes comerciais foi pesquisada nos 1620 isolados do presente trabalho. Os resultados obtidos foram analisados incluindo 2160 isolados provenientes de um estudo paralelo realizado em três vinhas da Região Languedoc (Sul de França). De entre os 3780 isolados, 296 apresentaram um perfil genético idêntico às estirpes comerciais utilizadas. Verificou-se uma incidência reduzida de leveduras comerciais (< 2 %) na flora fermentativa de uvas colhidas a uma distância superior a 100 m da adega. A partir de amostras mais próximas da adega e de riachos, a proporção de leveduras comerciais situava-se entre 10-43%, sendo que a maior parte (94%) foi encontrada em locais distanciados 10 a 200 m da adega. O conjunto de dados permitiu concluir que leveduras comerciais, apesar da sua abundante utilização anual, não permanecem nas vinhas e possuem um perfil de aparecimento/desaparecimento semelhante ao da flora indígena, não dominando a flora indígena. A sua disseminação está associada a distancias curtas por tempo limitado, sendo a água um factor importante. Três dos 101 isolados da estirpe Zymaflore VL1, recuperados de vinhas em proximidade da adega, apresentaram perda de heterozigosidade para 6 loci de microsatélites, tendo no entanto o mesmo teor de DNA que a estirpe comercial original. Vinhos produzidos na região dos Vinhos Verdes são caracterizados por uma elevada acidez volátil. Em S. cerevisiae o gene JEN1 que codifica para um sistema de transporte de ácidos monocarboxílicos está sujeito a repressão catabólica pela glucose. Como primeira abordagem para a obtenção de uma levedura geneticamente modificada, capaz de remover com eficácia ácido acético em mostos de uva, foi obtida uma estirpe que apresenta actividade para este sistema de transporte na presença de glucose