A procedure to validate and correct the 13C chemical shift calibration of RNA datasets

Chemical shifts reflect the structural environment of a certain nucleus and can be used to extract structural and dynamic information. Proper calibration is indispensable to extract such information from chemical shifts. Whereas a variety of procedures exist to verify the chemical shift calibration for proteins, no such procedure is available for RNAs to date. We present here a procedure to analyze and correct the calibration of 13C NMR data of RNAs. Our procedure uses five 13C chemical shifts as a reference, each of them found in a narrow shift range in most datasets deposited in the Biological Magnetic Resonance Bank. In 49 datasets we could evaluate the 13C calibration and detect errors or inconsistencies in RNA 13C chemical shifts based on these chemical shift reference values. More than half of the datasets (27 out of those 49) were found to be improperly referenced or contained inconsistencies. This large inconsistency rate possibly explains that no clear structure-13C chemical shift relationship has emerged for RNA so far. We were able to recalibrate or correct 17 datasets resulting in 39 usable 13C datasets. 6 new datasets from our lab were used to verify our method increasing the database to 45 usable datasets. We can now search for structure-chemical shift relationships with this improved list of 13C chemical shift data. This is demonstrated by a clear relationship between ribose 13C shifts and the sugar pucker, which can be used to predict a C2′- or C3′-endo conformation of the ribose with high accuracy. The improved quality of the chemical shift data allows statistical analysis with the potential to facilitate assignment procedures, and the extraction of restraints for structure calculations of RN

Recent advances in segmental isotope labeling of proteins: NMR applications to large proteins and glycoproteins

In the last 15years substantial advances have been made to place isotope labels in native and glycosylated proteins for NMR studies and structure determination. Key developments include segmental isotope labeling using Native Chemical Ligation, Expressed Protein Ligation and Protein Trans-Splicing. These advances are pushing the size limit of NMR spectroscopy further making larger proteins accessible for this technique. It is just emerging that segmental isotope labeling can be used to define inter-domain interactions in NMR structure determination. Labeling of post-translational modified proteins like glycoproteins remains difficult but some promising developments were recently achieved. Key achievements are segmental and site-specific labeling schemes that improve resonance assignment and structure determination of the glycan moiety. We adjusted the focus of this perspective article to concentrate on the NMR applications based on recent developments rather than on labeling methods themselves to illustrate the considerable potential for biomolecular NM

A strong 13C chemical shift signature provides the coordination mode of histidines in zinc-binding proteins

Zinc is the second most abundant metal ion incorporated in proteins, and is in many cases a crucial component of protein three-dimensional structures. Zinc ions are frequently coordinated by cysteine and histidine residues. Whereas cysteines bind to zinc via their unique Sγ atom, histidines can coordinate zinc with two different coordination modes, either Nδ1 or Nε2 is coordinating the zinc ion. The determination of this coordination mode is crucial for the accurate structure determination of a histidine-containing zinc-binding site by NMR. NMR chemical shifts contain a vast amount of information on local electronic and structural environments and surprisingly their utilization for the determination of the coordination mode of zinc-ligated histidines has been limited so far to 15N nuclei. In the present report, we observed that the 13C chemical shifts of aromatic carbons in zinc-ligated histidines represent a reliable signature of their coordination mode. Using a statistical analysis of 13C chemical shifts, we show that 13Cδ2 chemical shift is sensitive to the histidine coordination mode and that the chemical shift difference δ{13Cε1}−δ{13Cδ2} provides a reference-independent marker of this coordination mode. The present approach allows the direct determination of the coordination mode of zinc-ligated histidines even with non-isotopically enriched protein samples and without any prior structural informatio

Magnus and Dyson Series for Master Integrals

We elaborate on the method of differential equations for evaluating Feynman integrals. We focus on systems of equations for master integrals having a linear dependence on the dimensional parameter. For these systems we identify the criteria to bring them in a canonical form, recently identified by Henn, where the dependence of the dimensional parameter is disentangled from the kinematics. The determination of the transformation and the computation of the solution are obtained by using Magnus and Dyson series expansion. We apply the method to planar and non-planar two-loop QED vertex diagrams for massive fermions, and to non-planar two-loop integrals contributing to 2 -> 2 scattering of massless particles. The extension to systems which are polynomial in the dimensional parameter is discussed as well.Comment: 32 pages, 6 figures, 2 ancillary files. v2: references added, typos corrected in the text and in the ancillary file

Johanniskraut - von Inhaltsstoffen und anderen Unwägbarkeiten

Die Depression gehört zu den häufigsten Volkskrankheiten. Derzeit sind rund vier Millionen Deutsche an einer behandlungsbedürftigen Depression erkrankt. Die Erkrankung verläuft typischerweise in Form von Episoden, die Wochen bis Monate, manchmal auch Jahre anhalten können. Wenn die Erkrankung unbehandelt bleibt, kann sie wiederkehren und einen chronischen Verlauf nehmen. Rund 75 Prozent der Betroffenen erleiden nach einer Ersterkrankung innerhalb von fünf Jahren mindestens eine neue depressive Phase. Zudem werden mit steigender Episodenzahl die episodenfreien Zwischenzeiten immer kürzer. Es gilt heute als unstrittig, dass mehr als die Hälfte aller Depressionen nicht diagnostiziert und allenfalls ein Fünftel adäquat behandelt werden. Das verursacht nicht nur enorme Kosten für die Volkswirtschaft, sondern ist für die Betroffenen auch mit erheblichem Leid und Lebensgefahr verbunden

Radioaktive Implantate für medizinische Anwendungen

Der Erfolg chirurgischer Eingriffe wird nicht selten durch überschießende Wundheilung zunichte gemacht, so daß ein erneuter Eingriff notwendig wird. Am Wundort lokal eingesetzte Radionuklide mit kurzreichweitiger Strahlung können solche gutartigen Wucherungen verhindern. Das Radionuklid P-32 eignet sich als reiner Elektronenemitter mit einer Halbwertszeit von 14,3 Tagen und einer mittleren Energie von 694,9 keV (Emax=1710,48 keV) für diese Aufgabe und kann durch den Einfang thermischer Neutronen (1 · 10^14 /s/cm^2) im Kernreaktor aus dem stabilen P-31 hergestellt werden. Nach einer typischen Bestrahlungszeit (14 Tage) beträgt der P-32–Anteil 1,4 · 10^-5. Implantate aus Polymer bzw. bioresorbierbarem Material als Träger des radioaktiven Strahlers ermöglichen gegenüber metallischen Implantaten neue Anwendungen für diese Art der Strahlentherapie. In dieser Arbeit wurde eine Herstellungsmethode für bisher nicht verfügbare organische radioaktive Implantate entwickelt und ein dazugehöriges Dosimetriesystem aufgebaut. Mittels Ionenimplantation können P-32–Ionen mit bis zu 180 keV einige 100 nm tief in organische Implantatmaterialien eingeschossen werden. Für eine typische Dosis (15 Gy in 7 Tagen in 1 mm Abstand zum Implantat) wird eine Aktivität von 75 kBq benötigt, dies entspricht 1,3 · 10^11 P-32–Ionen. Die dafür optimierte Zerstäubungsionenquelle ermöglicht einen Ionenstrahl mit hohem Strahlstrom (>14 µA P–) und geringer Emittanz (<4 pi mm mrad MeV^1/2). Wegen der guten Strahlqualität können auch kleine Implantate (<1 mm^2) mit hoher Effizienz hergestellt werden. Durch eine Verbesserung der Isotopenselektion bei der Erzeugung des P-32–Strahls konnte der ungewollt mitimplantierte Anteil von Molekülen und Nukliden gleicher Masse (z. B. P-31H, O-16_2 und S-32) von etwa 500 auf 50 reduziert werden und somit im Vergleich zu den besten bisherigen Implantationsmethoden die Strahlenbelastung des Implantates um eine Größenordnung verringert werden. Bei der Betadosimetrie von 1–2 MeV Elektronen liegt die Herausforderung in der kurzen Reichweite (wenige Millimeter) im Gewebe und dem daraus folgenden starken Dosisabfall innerhalb dieses Bereichs. Dafür wurde eine Monte–Carlo–Simulation, basierend auf der Bibliothek Geant4, entwickelt. In diesem Dosisplanungssystem wurde, neben der Möglichkeit schematischer Geometrien, neu die Möglichkeit geschaffen, Rechnungen auf Basis von CT–Daten eines Patienten durchzuführen. Zur Überprüfung der Simulation wurde ein System für dreidimensionale dosimetrische Messungen mittels eines Plastikszintillators im Wasserphantom aufgebaut und die Simulationen innerhalb 10 % Abweichung reproduziert. Für die Überprüfung der Aktivität jedes hergestellten Implantates im Rahmen der Qualitätssicherung wurde ein Elektronenzählersystem aufgebaut. Die Kalibration erfolgte neben der herkömmlichen Methode durch Flüssigszintillationszählung zusätzlich mit Monte–Carlo–Simulationen. Diese ermöglichen die Kalibration auch für Implantatmaterialien, die sich nur schwer in Lösung bringen lassen wie die hier verwendeten Materialien Silikon oder Nickel–Titan–Legierungen. Die gemessenen, herstellungsbedingten Veränderungen der Materialeigenschaften von Silikon und dem bioresorbierbaren Polymer PLGA waren tolerierbar und bestätigten die Eignung als Implantatmaterial, insbesondere für die dauerhafte Fixierung des Radionuklids. An zwei klinischen Problemstellungen wurden die Implantate im Rahmen einer präklinischen Studie erprobt. Im Bereich der Hals–Nasen–Ohren–Medizin gibt es immer wieder Probleme mit verschlossenen Nasennebenhöhlen, die Infektionen zur Folge haben. Durch den Einsatz eines radioaktiven Silikonstents mit einer Liegezeit von 7 Tagen wurde gezeigt, daß eine künstlich geschaffene Öffnung langfristig offengehalten werden kann. Im Bereich der Augenheilkunde ist das Glaukom eine weit verbreitete Krankheit, die zur Erblindung führen kann. Diese durch einen übermäßigen Augeninnendruck erzeugte Krankheit kann mit Hilfe eines chirurgischen Eingriffs therapiert werden. Erstmals wurde ein bioresorbierbares radioaktives Implantat verwendet, welches geeignet ist, die künstlich geschaffene Abflußmöglichkeit offenzuhalten und so den Augeninnendruck langfristig zu senken. In einer klinischen Studie am Menschen wurde, im Gegensatz zu den anderen oben beschriebenen Anwendungen, nicht die wundheilungsdämpfende Wirkung geringer Dosen, sondern die sterilisierende Wirkung hoher Dosen eingesetzt. In Metastasen im Bereich der Lendenwirbel wurden mikrochirurgisch P-32–haltige Spiralen aus einer Nickel–Titan–Legierung eingebracht und bestrahlten diese mit ca. 100 Gy. Die bis zur Fertigstellung dieser Arbeit behandelten drei Patienten sind wohlauf und haben eine gute Verträglichkeit gegenüber den Implantaten gezeigt. Durch die im Verlauf dieser Arbeit geschaffenen Werkzeuge und Methoden können viele neue Anwendungsfelder für die Strahlentherapie benigner, aber auch maligner Erkrankungen erschlossen werden

Solid-state NMR spectroscopy of 10% 13C labeled ubiquitin: spectral simplification and stereospecific assignment of isopropyl groups

We describe the simplification of 13C-13C correlation spectra obtained from a microcrystalline protein sample expressed on a growth medium of 10% fully 13C labeled glucose diluted in 90% natural abundance glucose as compared to a fully labeled sample. Such a labeling scheme facilitates the backbone and side-chain resonance assignment of Phe, Tyr, His, Asp, Asn, Ile, Lys and Pro and yields an unambiguous stereospecific assignment of the valine Cγ1, Cγ2 13C resonances and of Leucine Cδ

NMR Spectroscopy: An Excellent Tool to Understand RNA and Carbohydrate Recognition by Proteins

Structural biology plays a key role in understanding how networks of protein interactions with their partners are organized at the atomic level. In this review, we show that NMR is a very efficient method to solve 3D structures of protein – RNA and protein–carbohydrate complexes of high quality. We explain the importance of studying such interactions and describe the main steps that are required to determine structures of these types of complexes by NMR. Finally, we show that X-ray crystallography and NMR are complementary methods and briefly report on advantages and disadvantages of each approach

Molecular basis for the wide range of affinity found in Csr/Rsm protein-RNA recognition

The carbon storage regulator/regulator of secondary metabolism (Csr/Rsm) type of small non-coding RNAs (sRNAs) is widespread throughout bacteria and acts by sequestering the global translation repressor protein CsrA/RsmE from the ribosome binding site of a subset of mRNAs. Although we have previously described the molecular basis of a high affinity RNA target bound to RsmE, it remains unknown how other lower affinity targets are recognized by the same protein. Here, we have determined the nuclear magnetic resonance solution structures of five separate GGA binding motifs of the sRNA RsmZ of Pseudomonas fluorescens in complex with RsmE. The structures explain how the variation of sequence and structural context of the GGA binding motifs modulate the binding affinity for RsmE by five orders of magnitude (∼10 nM to ∼3 mM, Kd). Furthermore, we see that conformational adaptation of protein side-chains and RNA enable recognition of different RNA sequences by the same protein contributing to binding affinity without conferring specificity. Overall, our findings illustrate how the variability in the Csr/Rsm protein-RNA recognition allows a fine-tuning of the competition between mRNAs and sRNAs for the CsrA/RsmE protei

Analyse der ökologischen Produktionsverfahren von Heil- und Gewürzpflanzen in Deutschland

Im Rahmen eines vom Bundesministerium für Verbraucherschutz, Ernährung und Landwirtschaft geförderten Projektes zum Thema „Analyse der ökologischen Produktionsverfahren von Heil- und Gewürzpflanzen in Deutschland“ führte die Sächsische Landesanstalt für Landwirtschaft eine bundesweite Befragung von landwirtschaftlichen Betrieben und Firmen der aufnehmenden Hand zum Anbau, zur Qualität und zu den Absatzchancen ökologischer Heil- und Gewürzpflanzen durch. Für diese sich über den Zeitraum von 07/2002 bis 10/2003 erstreckende Analyse konnten 66 Betriebe befragt werden. Sie repräsentieren insgesamt eine Anbaufläche an Heil- und Gewürzpflanzen von 704 ha. Der Anbau erfolgt vorwiegend auf kleinen Flächen (4 – 10 ha) und ist geprägt durch ein breites Artenspektrum (n = 108). Die ausführliche Analyse von 142 Produktionsverfahren der verschiedenen Heil- und Gewürzpflanzenarten (n = 44) vermittelt wertvolle Erfahrungen zur günstigen Gestaltung der einzelnen Verfahrensschritte des Anbaus und der Erntenachbehandlung. Ebenso werden die Absatzwege analysiert. Im Zuge der Befragung wurden aber auch generelle Schwachstellen in den Verfahrensabschnitten deutlich. Hervorzuheben ist diesbezüglich die geringe Anzahl der zur Verfügung stehenden Sorten bei den einzelnen Heil- und Gewürzpflanzenarten. Den ökologischen Anbau kennzeichnet ferner ein hoher Aufwand an maschinellen und manuellen Pflegearbeitsgängen. Bei vielen angebauten Heil- und Gewürzpflanzenarten wird auf unzureichende Pflanzenschutzmöglichkeiten hingewiesen. In der Ernte bestehen besonders bei Kraut- und Blütendrogen Schwachstellen. In allen Erntenachbehandlungsstufen bestehen partielle Schwachstellen wie ungenügende Steuerungsmöglichkeit der Trocknungstemperatur, Schwierigkeiten beim Ausreinigen bestimmter Unkraut- und Gräsersamen und Abscheiden von anorganischen Fremdbestandteilen im Waschvorgang. Die Hauptaufkäufer der aufbereiteten Ware sind Großabnehmer (Händler, Erzeugergemeinschaften, Arzneimittelhersteller). Befragte Firmen der aufnehmenden Hand (n = 60) zeigten sich zufrieden mit der Qualität ökologischer Heil- und Gewürzpflanzen aus deutschem Anbau. Sowohl bei den Landwirten als auch bei den Partnern aus der Industrie gibt es eine optimistische Grundstimmung zur Ausdehnung des ökologischen Anbaus von Heil- und Gewürzpflanzen in Deutschland. Im Projekt werden Vorschläge zur weiteren Stärkung des ökologischen Heil- und Gewürzpflanzenanbaus unterbreitet