Enhancement of gene delivery by an analogue of α-MSH in a receptor-independent fashion

AbstractIn order to transfect melanoma specifically by receptor-mediated endocytosis we prepared dioctadecyl aminoglycylspermine (lipospermine)–DNA complexes with [Nle4,D-Phe7]-α-MSH(4–10), a pseudo-peptide analogue of α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) linked to a thiol-reactive phospholipid. With these complexes we obtained an up to 70-fold increase of transfection with B16-F1 melanoma cells. However when B16-G4F, an α-MSH receptor negative melanoma cell line was transfected, an up to 700-fold increased transfection efficiency was observed. The peptide hormone analogue was equally efficient when it was only mixed with lipospermine–DNA complexes without covalent coupling. In addition to melanoma cells we also obtained up to 30-fold increased transfection with BN cells (embryonic liver cells). Our data show that an α-MSH analogue increased transfection independently of the MSH receptor expression but reaches efficiencies approaching those obtained with peptides derived from viral fusion proteins. The absence of targeting of constructs containing [Nle4,D-Phe7]-α-MSH(4–10) can probably be attributed due to the relatively modest number of MSH receptors at the surface of melanoma. We suggest, however, that the peptide hormone analogue used in this study has membrane-active properties and could be of interest as helper agent to enhance non-viral gene delivery presumably by endosomal-destabilizing properties

Insights into the Mechanism of Bovine CD38/NAD+Glycohydrolase from the X-Ray Structures of Its Michaelis Complex and Covalently-Trapped Intermediates

Bovine CD38/NAD+glycohydrolase (bCD38) catalyses the hydrolysis of NAD+ into nicotinamide and ADP-ribose and the formation of cyclic ADP-ribose (cADPR). We solved the crystal structures of the mono N-glycosylated forms of the ecto-domain of bCD38 or the catalytic residue mutant Glu218Gln in their apo state or bound to aFNAD or rFNAD, two 2′-fluorinated analogs of NAD+. Both compounds behave as mechanism-based inhibitors, allowing the trapping of a reaction intermediate covalently linked to Glu218. Compared to the non-covalent (Michaelis) complex, the ligands adopt a more folded conformation in the covalent complexes. Altogether these crystallographic snapshots along the reaction pathway reveal the drastic conformational rearrangements undergone by the ligand during catalysis with the repositioning of its adenine ring from a solvent-exposed position stacked against Trp168 to a more buried position stacked against Trp181. This adenine flipping between conserved tryptophans is a prerequisite for the proper positioning of the N1 of the adenine ring to perform the nucleophilic attack on the C1′ of the ribofuranoside ring ultimately yielding cADPR. In all structures, however, the adenine ring adopts the most thermodynamically favorable anti conformation, explaining why cyclization, which requires a syn conformation, remains a rare alternate event in the reactions catalyzed by bCD38 (cADPR represents only 1% of the reaction products). In the Michaelis complex, the substrate is bound in a constrained conformation; the enzyme uses this ground-state destabilization, in addition to a hydrophobic environment and desolvation of the nicotinamide-ribosyl bond, to destabilize the scissile bond leading to the formation of a ribooxocarbenium ion intermediate. The Glu218 side chain stabilizes this reaction intermediate and plays another important role during catalysis by polarizing the 2′-OH of the substrate NAD+. Based on our structural analysis and data on active site mutants, we propose a detailed analysis of the catalytic mechanism

Développement de formulations vaccinales anti-cancéreuses à base de liposomes vectorisant des adjuvants et des antigènes peptidiques synthétiques

Le but d'une approche vaccinale anti-cancéreuse est d'induire une réponse immunitaire cellulaire puissante et tumeur-spécifique, conduisant à l'élimination des tumeurs (vaccin thérapeutique) ou à la prévention contre les tumeurs (vaccin prophylactique). Nous avons conçu des constructions minimales, entièrement synthétiques, reposant sur l'utilisation de peptides antigéniques (épitopes) vectorisés par des liposomes. Dans ce but, les peptides, dérivatisés par un résidu cystéine, sont couplés d'une manière chimiosélective à la surface de vésicules préformées grâce à une ancre amphiphile lipopeptidique adjuvante (Pam3CysSerSer) fonctionnalisée par un groupement maléimide. Dans une première approche, nous avons greffé deux peptides à la surface de liposomes de type " SUV " (Ø 65 nm) : un épitope T-cytotoxique (Tc) dérivé du récepteur humain ErbB2 surexprimé dans de nombreux cancers et un épitope T-auxiliaire (Th) "universel" qui augmente l'intensité de la réponse contre l'épitope Tc. Cette construction vaccinale a été testée in vivo sur des modèles murins (tumeur syngénique exprimant le récepteur ErbB2 humain) dans le cadre d'une visée prophylactique. Les résultats obtenus se sont montrés extrêmement encourageants puisque nous n'avons observé aucune croissance de tumeurs lorsque les souris sont vaccinées (s.c.) avec notre formulation. Il est à noter en revanche qu'une réponse significativement moins forte a été observée lorsque le peptide Th n'est pas présent dans la formulation. Un effet mémoire a également été mis en évidence. Nous avons par ailleurs réalisé le même type d'expérimentation mais dans le cadre d'une vaccination thérapeutique. Les résultats obtenus sont également très prometteurs, puisque la majorité des souris ont vu leur tumeur éradiquée après vaccination avec notre formulation. L'utilisation d'une telle stratégie pour la conception d'un vaccin anti-cancéreux est donc très prometteuse.The aim of an antitumor vaccine approach is to induce an immune response which is a potent cellular and tumor-specific response, leading to tumors elimination (therapeutic vaccine) or to prevention against tumors (prophylactic vaccine). We realized minimal entirely synthetic constructions based on the use of antigenic peptides (epitopes) vectorized by liposomes. In this aim, the peptides, derivatized by a cysteine residue, are conjugated chemoselectively at the surface of preformed vesicles via an amphiphile adjuvant lipopeptidic anchor (Pam3CysSerSer) functionalized by a maleimide moiety. In a first approach, we coupled two peptides at the surface of liposomes of "SUV" type (ø " 65 nm) : a T-cytotoxic (Tc) epitope derived from the human ErbB2 receptor which is overexpressed in numerous cancers, and a "universal" T-helper (Th) epitope that increases the intensity of the response against the Tc epitope. This vaccine construct was tested in vivo on murine models (syngeneic tumors expressing the human ErbB2 receptor) in a prophylactic manner. The obtained results are very encouraging since we did not observe any tumor growings when the mice were vaccinated (s.c.) with our formulation. It is to be noted, although, that a response significatively less potent was observed when the Th epitope was not present in the formulation. A memory effect was also detected. We did the same experimentations but for a therapeutic vaccination. The obtained results are also very promising, since the majority of mice were tumor free (tumors eradicated) after therapeutic vaccination. For conclusion, the use of such strategy for the conception of an antitumor vaccine is very promising.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Influence des propriétés pharmacologiques, structurales et physico-chimiques de drogues sur leur biodisponibilité oculaire

STRASBOURG ILLKIRCH-Pharmacie (672182101) / SudocSudocFranceF

Les vecteurs de transfection non-viraux (synthèse d'une lipospermine)

STRASBOURG ILLKIRCH-Pharmacie (672182101) / SudocSudocFranceF

Mécanisme cinétique et moléculaire de CD38/NAD+glycohydrolase en relation avec la signalisation intracellulaire

Le CD38/NAD+glycohydrolase (EC 3.2.2.5 et 3.2.2.6), conservé dans l'évolution, est à la fois une glycoprotéine transmembranaire de type II qui possède des propriétés de signalisation notamment chez les lymphocytes et d'adhésion cellulaire et une ectoenzyme qui transforme le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) en ADP-ribose cyclique (ADPRc), un second messager impliqué dans la mobilisation du calcium intracellulaire dans une variété de cellules aussi bien chez les mammifères que chez les plantes et les invertébrés. La question posée était de savoir si l'activité catalytique du CD38/NADase est directement responsable de la signalisation intracellulaire induite par son activation. Selon notre hypothèse, seul un changement conformationnel de l'enzyme, conduisant à une interaction avec des partenaires de surface cellulaire, serait responsable de son implication dans la signalisation intracellulaire et indépendamment des produits de la réaction enzymatique. Ce travail de thèse consistait donc à éclaircir cette problématique selon deux approches complémentaires : 1) après avoir établi un schéma cinétique unificateur pour les enzymes de mammifères et d'invertébrés impliqués dans la biosynthèse de l'ADPRc, il s'agissait d'étudier le mécanisme cinétique et moléculaire en modulant les différentes constantes cinétiques et vérifier l'implication de l'ADPRc complexé à l'enzyme dans la signalisation 2) dans une deuxième partie, il s'agissait d'étudier la relation entre la structure du CD38/NADase et ses fonctions catalytiques et de signalisation en effectuant différentes mutations à des endroits de l'enzyme susceptibles d'être impliqués dans la catalyse et/ou la liaison du substrat. Ce travail a permis de conclure que seule la fixation de ligands (substrat, anticorps) serait responsable d'un changement conformationnel du CD38/NADase, conduisant à un dialogue avec les partenaires de signalisation.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

MISE AU POINT ET ETUDE D'OUTILS MOLECULAIRES POUR LA TRANSFECTION CIBLEE DE GENES (DOCTORAT (PHARMACOCHIMIE))

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