Theoretical and Experimental Examination of EGF Receptor Endocytosis

In der hier präsentierten Arbeit behandeln wir die Zusammenführung von prädiktiven mathematischen Modellen und experimentellen Daten zu EGF Rezeptor Endozytose. Dieser Rezeptor ist vor allem für die Weiterleitung von Wachstumssignalen verantwortlich. In der Arbeit wurde insbesondere die Internalisierung selbst, sowie die Sortierung in Clathrin-abhängige wie -unabhängige Pathways untersucht. Das genaue Verständnis der Mechanismen von EGF Rezeptor Endozytose ist aus mehrfacher Hinsicht erstrebenswert: Endozytose, d.h. die Verlagerung des aktivierten Rezeptors von der Zelloberfläche in intrazelluläre Kompartimente, dient dazu, die Signalweiterleitung (Spezifität, Stärke, Dauer) zu kontrollieren. Entsprechend können abnorme Veränderungen des Endozytoseapparats z.B. durch Mutationen oder virale Infektion schwerwiegende Folgen für den zellulären Haushalt (Krebs) haben. Im ersten Teil der Arbeit präsentieren wir eine Kombination aus mathematischer Modellierung, konfokaler Mikroskopie und Mehrfarben-Flow Cytometry, um die Internalisierung in einzelnen Zellen quantitativ zu erfassen. Das Modell wird benutzt, um die Wirkung von Rezeptorüberexpression auf den Internalisierungsvorgang zu untersuchen (H.S-G et al, zur Publikation akzeptiert in JBC). Im zweiten Teil der Arbeit legen wir ein mathematisches Modell vor, welches die Sortierung von aktivierten Rezeptoren in unterschiedliche Endozytosewege beschreibt. Dies ist nicht nur aus biologischmedizinischen Gründen, sondern auch aus Sicht der mathematischen Modellierung und Systembiologie interessant, da sie als Beispiel für einen allgemeinen zellulären Entscheidungsprozess aufgefasst werden kann. Das hier vorgelegte Modell beinhaltet den Mechanismus eines Schalterverhaltens, welches kontinuerliche Signale in ein 'Alles-oder-Nichts' Outputverhalten umwandelt (H.S-G et al, BMC Systems Biology, 2008). Die mathematische Struktur und die Relevanz für zellbiologische Prozesse dieser Art von Modellen wird in der Einleitung ausführlich besprochen. Schließlich, um das erarbeitete Modell experimentell zu testen, wurden quantitative Vorhersagen abgeleitet, die vor allem mit Hilfe von konfokaler Mikroskopie untersucht wurden. Um die Bilddaten auszuwerten, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Bildverarbeitungssoftware entwickelt, mit der sich Vesikelstrukturen automatisch detektieren und quantifizieren lassen (Manuskript zur Veröffentlichung eingereicht). Diese experimentellen Untersuchungen werden im dritten Ergebnisteil vorgestellt. Hierbei wurde insbesondere selektive Hemmung von Clathrin- oder Caveolin-abhangigen pathways auf das Endozytoseverhalten des EGF Rezeptors untersucht. Das Hauptergebnis dieses Teils der Arbeit ist, dass aktivierte Rezeptoren vorrangig über Clathrin-abhängige Mechanismen internalisieren. Caveolin hingegen ist für den intrazellulären Transport und die Inaktivierung des internalisierten Rezeptors wichtig (Manuskript in Vorbereitung). Insgesamt stellt die Arbeit einen biomathematischen Ansatz zur Beschreibung von Wachstumsfaktoren auf zelluläre Prozesse dar und liefert damit einen Beitrag zu dem sich im Entstehenden befindenden Gebiet der Systembiologie

An ultrasensitive sorting mechanism for EGF receptor endocytosis

Background The EGF receptor has been shown to internalize via clathrin-independent endocytosis (CIE) in a ligand concentration dependent manner. From a modeling point of view, this resembles an ultrasensitive response, which is the ability of signaling networks to suppress a response for low input values and to increase to a pre-defined level for inputs exceeding a certain threshold. Several mechanisms to generate this behaviour have been described theoretically, the underlying assumptions of which, however, have not been experimentally demonstrated for the EGF receptor internalization network. Results Here, we present a mathematical model of receptor sorting into alternative pathways that explains the EGF-concentration dependent response of CIE. The described mechanism involves a saturation effect of the dominant clathrin-dependent endocytosis pathway and implies distinct steady-states into which the system is forced for low vs high EGF stimulations. The model is minimal since no experimentally unjustified reactions or parameter assumptions are imposed. We demonstrate the robustness of the sorting effect for large parameter variations and give an analytic derivation for alternative steady-states that are reached. Further, we describe extensibility of the model to more than two pathways which might play a role in contexts other than receptor internalization. Conclusions Our main result is that a scenario where different endocytosis routes consume the same form of receptor corroborates the observation of a clear-cut, stimulus dependent sorting. This is especially important since a receptor modification discriminating between the pathways has not been found. The model is not restricted to EGF receptor internalization and might account for ultrasensitivity in other cellular contexts

single-HXT2 without sensors in 0.1% glucose, 2500 ng/ml DOX AND single-HXT4 without sensors in 0.1% or 2% glucose 2500ng/ml DOX

Single-HXT2 without sensors were grown in 0.1% glucose, with 2500ng/ml DOX. Field of view 41 to 60. Single-HXT4 without sensors were grown in 0.1% (Fields of view 41 to 60) or 2% (Fields of view 61 to 80) glucose, with 2500ng/ml DOX

Data from: Loss of growth homeostasis by genetic decoupling of cell division from biomass growth: implication for size control mechanisms

Growing cells adjust their division time with biomass accumulation to maintain growth homeostasis. Size control mechanisms, such as the size checkpoint, provide an inherent coupling of growth and division by gating certain cell cycle transitions based on cell size. We describe genetic manipulations that decouple cell division from cell size, leading to the loss of growth homeostasis, with cells becoming progressively smaller or progressively larger until arresting. This was achieved by modulating glucose influx independently of external glucose. Division rate followed glucose influx, while volume growth was largely defined by external glucose. Therefore, the coordination of size and division observed in wild‐type cells reflects tuning of two parallel processes, which is only refined by an inherent feedback‐dependent coupling. We present a class of size control models explaining the observed breakdowns of growth homeostasis

single-HXT2 with sensors in 0.1% glucose, 1250ng/ml DOX

single-HXT2 with sensors were grown in 0.1% glucose, with 1250ng/ml DOX. Field of view 41 to 60

single-HXT2 with sensors in 0.1% glucose, 2500ng/ml DOX

single-HXT2 with sensors were grown in 0.1% glucose, with 2500ng/ml DOX. Field of view 41 to 60

wildtype cells grown 2% glucose

Wildtype cells grown in SC with 2% glucose. Fields of view 27 to 41. Images were taken every 10 minutes. Corresponds to figure 1B, 1C

single-HXT2 with sensors in 0.1% glucose, 250ng/ml DOX

single-HXT2 with sensors were grown in 0.1% glucose, with 250ng/ml DOX. Fields of view 41 to 60

Transporterless cells without sensors in 0% or 2% glucose

Transporterless cells without sensors were grown in 0% (Fields of view 1 to 20) or 2% (Fields of view 61 to 80) glucose. Corresponds to figures 1H (2%) and 1I (0%) Images were taken every 10 minutes

single-HXT2 with sensors in 0.1% glucose, 125ng/ml DOX

single-HXT2 with sensors were grown in 0.1% glucose, with 125ng/ml DOX. Fields of view 41 to 60