Schlussleisten (Zonulae occludentes) und biochemisch verwandte Strukturen: Tight Junction-Proteine und -Funktionen in mehrschichtigen Epithelien, mit besonderer Berücksichtigung der Plattenepithelmetaplasie

In vielzelligen Organismen bilden Epithelien an der Körperoberfläche und als Auskleidung der inneren Lumina funktionelle Grenzschichten, die sowohl das Körperinnere von der äußeren Umwelt und die Fortsetzung der Körperoberfläche, d.h. die Lumina der Organe trennen als auch das Körperinnere in verschiedene Kompartimente unterteilen. Dabei sind die Epithelzellen jeweils in charakteristischer Weise durch verschiedene Zell-Zell-Verbindungen zu einem bestimmten Epithelgewebe gekoppelt. Die „Tight Junctions“ (TJ) sind dabei für die Herstellung und Aufrechterhaltung der unterschiedlichen molekularen Zusammensetzungen der einzelnen Kompartimente, vor allem als Haupt-Barriere für die parazelluläre Ausbreitung von Zellen, Partikeln und vielen Molekülarten, besonders wichtig. Während die Zell-Zell-Verbindungen der TJ seit den 1960er Jahren in einschichtigen polaren Epithelien sowohl strukturell als auch funktionell eingehend untersucht worden sind, galt bis zur Jahrtausendwende noch die überwiegende Ansicht in der Fachliteratur – auch als Lehrbuchdogma -, dass TJ oder äquivalente Strukturen in mehrschichtigen Epithelien nicht vorkommen und hier andere Strukturen, nämlich interzelluläre Lipid-Akkumulationen, für die Bildung und Aufrechterhaltung der Barriere-Funktion verantwortlich sind. Nachdem in den letzten Jahren jedoch TJ-Proteine sowie TJ-artige Strukturen und Funktionen in einigen mehrschichtigen Epithelien und davon abgeleiteten Geweben (Hassall-korpuskel und Tumoren) nachgewiesen worden sind, sollte in der vorliegenden Dissertation geklärt werden, welche TJ-Proteine in bestimmten TJ-Strukturen oder in sog. „TJ-verwandten“ Anordnungen in mehrschichtigen Epithelien von Säugetieren vorkommen. Außerdem sollte geklärt werden, ob und wie pathologische mehrschichtige Epithel-Bildungen wie sog. Plattenepithel-Metaplasien oder bestimmte Strukturen in Plattenepithel-karzinomen typische TJ-Proteine enthalten können. Bei diesen Untersuchungen konnten zunächst kleine, punkt- oder zapfenförmig erscheinende TJ-artige Membran-Kontaktstellen als häufige interdesmosomale Strukturen nachgewiesen werden: Mit Hilfe der Gefrierbruchtechnik ließen sich elektronenmikroskopisch in der Membranspaltebene zwischen den Desmosomen diese kleinen Strukturelemente als säulenstumpfartige Erhebungen von bis zu ca. 12 nm Durchmesser darstellen, die an manchen Stellen auch zu linearen, z.T. gewundenen und verzweigten Reliefbändern fusioniert erschienen. Zumindest in bestimmten Plattenepithelien entsprachen die Positionen dieser interdesmosomalen Membran-Kontakte in licht- wie in elektronenmikroskopischen Immunlokalisierungsexperimenten Stellen, an denen typische TJ-Proteine wie z.B. Occludin oder bestimmte Claudine angereichert waren. Diese neuartigen TJ-Protein-Strukturen wurden daher als „Stud Junctions“ (Puncta occludentia) bezeichnet und mit anderen TJ-verwandten, Claudin- bzw. Occludin-haltigen interdesmosomalen Strukturen wie den „Lamellated Junctions“ oder den „Sandwich Junctions“ einiger Plattenepithelien verglichen. Zur möglichen molekularen Struktur und zur Bedeutung dieser „Stud Junctions“ werden Hypothesen vorgestellt. Weiterhin konnten TJ-Proteine und sowohl typische TJ- als auch TJ-verwandte Strukturen in metaplastisch verändertem Bronchialepithel in situ und in vermeintlich mehrschichtigen Zellkultur-Modellen der Plattenepithelmetaplasie nachgewiesen werden, wobei z.T. auch die jeweilige Fähigkeit, eine Barriere-Funktion in der Kulturschale auszuüben, untersucht wurde. Durch biochemische und immunologische Analysen ließen sich dabei TJ-Proteine wie Claudin-1, Claudin-4 und Claudin-7 nachweisen, vielfach zusammen mit Occludin bzw. Protein ZO-1. Elektrophysiologische Messungen ergaben aber, dass in sog. „Monolayer“-Kulturen von aus Bronchialepithelien abgeleiteten Zellen diese TJ-artigen Gebilde für die Barriere-Funktion allenfalls nur eine sehr geringe Bedeutung haben können. Denn im Vergleich mit der von einem Kolonkarzinom abgeleiteten, polaren Epithelzell-Linie CaCo-2 wiesen die polaren bronchialepithelialen Zellen der Linien 16HBE und CaLu-3 recht niedrige - und die an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht induzierten Metaplasie-Modelle („Multilayer“-Kulturen) sogar nur äußerst geringe - Widerstandswerte auf, deren Signifikanz überdies noch zweifelhaft blieb. Biochemische Befunde, vor allem bei Immunpräzipitationsexperimenten, legten außerdem den Schluss nahe, dass bei diesen bronchialepithelialen Zellkulturen 1 Zusammenfassung Claudin-1 mit Claudin-7 und dem ebenfalls vorkommenden Claudin-4 Komplexe bilden kann. Dagegen wurden bei CaCo-2 Zellen ausschließlich Interaktionen von Claudin-1 mit Claudin-7 nachgewiesen. Zusätzlich konnten TJ-Proteine (z.B. Occludin, Claudin-1, Claudin-4, Claudin-7, Protein ZO-1, Cingulin) und zum Teil auch TJ-artige Strukturen in bestimmten Bereichen unterschiedlich differenzierter Plattenepithelkarzinome - auch der Lunge - und in Plattenepithelmetaplasien in situ sowie in den entsprechenden Zellkulturmodellen erkannt werden. Auch das erst jüngst entdeckte TJ-Transmembranprotein Tricellulin konnte an den jeweiligen Kontaktstellen von drei Zellen nicht nur in einschichtigen Epithelien und davon abgeleiteten Zellkulturlinien lokalisiert werden, sondern auch an den entsprechenden Stellen in der obersten Schicht von Kulturen mehrschichtiger Keratinocyten der menschlichen HaCaT-Linie. Ein Nachweis von Tricellulin-haltigen Kontakten in mehrschichtigen Epithelien in situ scheiterte allerdings bisher daran, dass im Menschen – mindstens - zwei Spleißformen des Tricellulin-Gens vorkommen, aber für die hier wohl relevante zweite Spleißvariante bisher noch kein spezifischer Antikörper zur Verfügung stand. Die Barriere- bzw. Selektions-Funktion der TJ-Strukturen in mehrschichtigen Epithelien und entsprechenden Zellkultur-Modellen konnte auch mit Hilfe wasserlöslicher Nachweismittel (Tracer) wie z.B. LaCl3 oder mit Dextran-Partikeln verschiedener Größe elektronen-mikroskopisch bzw. in physiologischen Translokationsexperimenten bestätigt werden. Die Befunde werden auch im Zusammenhang mit der Hypothese einer extrazellulären „Lipid-Barriere“ diskutiert bzw. als Bestätigung der Vorstellung, dass es in vielen, vielleicht allen Plattenepithelien zwei verschiedene Barriere-Systeme für parazelluläre Molekülverteilungen gibt, die beide essentiell, aber auch komplementär sind, d.h. dass es sowohl ein TJ-System als auch eine Absperrung durch interzelluläre lipidreiche Dichtungen gibt. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen also, dass es in mehrschichtigen Epithelien generell TJ-Proteine in verschiedenen TJ-artigen Struktursystemen, aber auch in weiteren, bisher noch nicht hinreichend erforschten „Junction“-Strukturen gibt, wobei in jedem Fall mindestens ein komplettes „Abschluss-System“ in den obersten lebenden Zellschichten vorkommt und wohl essentiell ist. Von den zusätzlichen TJ-Protein-haltigen Strukturen ist das in dieser Arbeit definierte interdesmosomale Punctum occludens das räumlich kleinste, durch seine Häufigkeit aber sicherlich auch bemerkenswerteste Strukturelement, das es nun in zukünftigen Experimenten in seiner Funktion und möglichen Beteiligung beim Aufbau größerer TJ-Strukturen aufzuklären gilt. Während die Bronchial-Plattenepithel-Metaplasie in situ einem ähnlichen geordneten Aufbau wie andere Plattenepithelien aufweist, stellen die mehrschichtig erscheinenden Zellkultur-Systeme bronchialepithelialer Herkunft kein Kultur-Modell einer Metaplasie, sondern eine Zellkultur-Struktur sui generis dar, bei der TJ-artige Molekülanordnungen in praktisch allen Zellschichten vorkommen. Die Bedeutung dieser Befunde für einige Funktionen solcher Epithelien, bestimmter krankhafter Entartungen (Plattenepithelmetaplasien) und in der zukunftigen Tumordiagnostik wird diskutiert

Cultivation-independent screening revealed hot spots of IncP-1, IncP-7 and IncP-9 plasmid occurrence in different environmental habitats

IncP-1, IncP-7 and IncP-9 plasmids often carry genes encoding enzymes involved in the degradation of man-made and natural contaminants, thus contributing to bacterial survival in polluted environments. However, the lack of suitable molecular tools often limits the detection of these plasmids in the environment. In this study, PCR followed by Southern blot hybridization detected the presence of plasmid-specific sequences in total community (TC-) DNA or fosmid DNA from samples originating from different environments and geographic regions. A novel primer system targeting IncP-9 plasmids was developed and applied along with established primers for IncP-1 and IncP-7. Screening TC-DNA from biopurification systems (BPS) which are used on farms for the purification of pesticide-contaminated water revealed high abundances of IncP-1 plasmids belonging to different subgroups as well as IncP-7 and IncP-9. The novel IncP-9 primer-system targeting the rep gene of nine IncP-9 subgroups allowed the detection of a high diversity of IncP-9 plasmid specific sequences in environments with different sources of pollution. Thus polluted sites are "hot spots" of plasmids potentially carrying catabolic genes.Facultad de Ciencias ExactasInstituto de Biotecnologia y Biologia Molecula

Cultivation-independent screening revealed hot spots of IncP-1, IncP-7 and IncP-9 plasmid occurrence in different environmental habitats

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Toxoplasma gondii Actively Inhibits Neuronal Function in Chronically Infected Mice

Upon infection with the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii, fast replicating tachyzoites infect a broad spectrum of host cells including neurons. Under the pressure of the immune response, tachyzoites convert into slow-replicating bradyzoites, which persist as cysts in neurons. Currently, it is unclear whether T. gondii alters the functional activity of neurons, which may contribute to altered behaviour of T. gondii–infected mice and men. In the present study we demonstrate that upon oral infection with T. gondii cysts, chronically infected BALB/c mice lost over time their natural fear against cat urine which was paralleled by the persistence of the parasite in brain regions affecting behaviour and odor perception. Detailed immunohistochemistry showed that in infected neurons not only parasitic cysts but also the host cell cytoplasm and some axons stained positive for Toxoplasma antigen suggesting that parasitic proteins might directly interfere with neuronal function. In fact, in vitro live cell calcium (Ca2+) imaging studies revealed that tachyzoites actively manipulated Ca2+ signalling upon glutamate stimulation leading either to hyper- or hypo-responsive neurons. Experiments with the endoplasmatic reticulum Ca2+ uptake inhibitor thapsigargin indicate that tachyzoites deplete Ca2+ stores in the endoplasmatic reticulum. Furthermore in vivo studies revealed that the activity-dependent uptake of the potassium analogue thallium was reduced in cyst harbouring neurons indicating their functional impairment. The percentage of non-functional neurons increased over time In conclusion, both bradyzoites and tachyzoites functionally silence infected neurons, which may significantly contribute to the altered behaviour of the host

The Coastal Observing System for Northern and Arctic Seas (COSYNA)

The Coastal Observing System for Northern and Arctic Seas (COSYNA) was established in order to better understand the complex interdisciplinary processes of northern seas and the Arctic coasts in a changing environment. Particular focus is given to the German Bight in the North Sea as a prime example of a heavily used coastal area, and Svalbard as an example of an Arctic coast that is under strong pressure due to global change. The COSYNA automated observing and modelling system is designed to monitor real-time conditions and provide short-term forecasts, data, and data products to help assess the impact of anthropogenically induced change. Observations are carried out by combining satellite and radar remote sensing with various in situ platforms. Novel sensors, instruments, and algorithms are developed to further improve the understanding of the interdisciplinary interactions between physics, biogeochemistry, and the ecology of coastal seas. New modelling and data assimilation techniques are used to integrate observations and models in a quasi-operational system providing descriptions and forecasts of key hydrographic variables. Data and data products are publicly available free of charge and in real time. They are used by multiple interest groups in science, agencies, politics, industry, and the public

Visualization and quantification of capillary drainage in the pore space of laminated sandstone by a porous plate method using differential imaging X-ray microtomography

The experimental determination of capillary pressure drainage curves at the pore scale is of vital importance for the mapping of reservoir fluid distribution. To fully characterize capillary drainage in a complex pore space, we design a differential imaging-based porous plate (DIPP) method using X-ray micro- tomography. For an exemplar mm-scale laminated sandstone microcore with a porous plate, we quantify the displacement from resolvable macropores and subresolution micropores. Nitrogen (N 2 ) was injected as the nonwetting phase at a constant pressure while the porous plate prevented its escape. The measured porosity and capillary pressure at the imaged saturations agree well with helium measurements and experi- ments on larger core samples, while providing a pore-scale explanation of the fluid distribution. We observed that the majority of the brine was displaced by N 2 in macropores at low capillary pressures, fol- lowed by a further brine displacement in micropores when capillary pressure increases. Furthermore, we were able to discern that brine predominantly remained within the subresolution micropores, such as regions of fine lamination. The capillary pressure curve for pressures ranging from 0 to 1151 kPa is provided from the image analysis compares well with the conventional porous plate method for a cm-scale core but was conducted over a period of 10 days rather than up to few months with the conventional porous plate method. Overall, we demonstrate the capability of our method to provide quantitative information on two- phase saturation in heterogeneous core samples for a wide range of capillary pressures even at scales smaller than the micro-CT resolutio

Cultivation-independent screening revealed hot spots of IncP-1, IncP-7 and IncP-9 plasmid occurrence in different environmental habitats

IncP-1, IncP-7 and IncP-9 plasmids often carry genes encoding enzymes involved in the degradation of man-made and natural contaminants, thus contributing to bacterial survival in polluted environments. However, the lack of suitable molecular tools often limits the detection of these plasmids in the environment. In this study, PCR followed by Southern blot hybridization detected the presence of plasmid-specific sequences in total community (TC-) DNA or fosmid DNA from samples originating from different environments and geographic regions. A novel primer system targeting IncP-9 plasmids was developed and applied along with established primers for IncP-1 and IncP-7. Screening TC-DNA from biopurification systems (BPS) which are used on farms for the purification of pesticide-contaminated water revealed high abundances of IncP-1 plasmids belonging to different subgroups as well as IncP-7 and IncP-9. The novel IncP-9 primer-system targeting the rep gene of nine IncP-9 subgroups allowed the detection of a high diversity of IncP-9 plasmid specific sequences in environments with different sources of pollution. Thus polluted sites are "hot spots" of plasmids potentially carrying catabolic genes.Facultad de Ciencias ExactasInstituto de Biotecnologia y Biologia Molecula