Characterization of Schizosaccharomyces pombe chromosome condensation factor Zas1

Pro Sekunde teilen sich mehr als 3 Millionen Zellen im menschlichen Körper (Notta et al., 2016). Bei jeder dieser Zellteilungen muss die korrekte Verteilung der Chromosomen - die Träger der genetischen Information - gewährleistet werden. Ist die Verteilung der genetischen Information ungleichmäßig, z. B. aufgrund eines fehlenden oder überschüssigen Chromosoms, kommt es zum Tod der betroffenen Tochterzelle oder Krebs. So hat sich eine faszinierend zuverlässige Machinerie entwickelt, die in der Mitose die etwa 2 Meter menschlicher DNA zuerst eng verpackt und dann an die Zellpole transportiert, sodass sich die etwa 20 Mikrometer große Zelle durchschnüren kann. Die Kompaktierung des Chromatins - genannt Chromosomenkondensation - ist eines der am wenigsten verstandenden Prozesse der Zellteilung. Um die Chromosomenkondensation besser untersuchen zu können, ist ein Mikroskopie basiertes Chromosomenkondensationsmessverfahren in der Spalthefe S. pombe entwickelt worden, welches auf spezifischer Fluo- reszenzmarkierung zweier Loci beruht. Mittels dieses Messverfahrens wurden aus einer Kollektion zufälliger, wärmeempfindlicher Mutanten drei Allele des zuvor kaum charakterisierten Gens zas1 identifiziert, bei denen die Chromosomenkondensation beeinträchtigt ist (Petrova, 2012). In der vorliegenden Arbeit charakterisiere ich zas1 und zeige, das seine Funktion von seinen Zinkfinger Domänen und einer kurzen, E2F-ähnlichen Peptidsequenz, welche zuvor noch nie in Einzellern beschrieben wurde, abhängt. Ich stelle fest, dass Zas1 die Transkription der Condensin-Untereinheit Cnd1 reguliert, was den Kondensationsdefekt in zas1 Mutanten erklärt. Damit wird zum ersten Mal ein Transkriptionsfaktor für eine Condensin-Untereinheit in S. pombe beschrieben. Im zweiten Teil der Arbeit verbessere ich das Chromosomenkondensationsmessverfahren, indem ich die rechnergestützte Bildverarbeitung und Datenanalyse weitestgehend automatisiere. Diese Optimierungen ermöglichen es, die Variabilität zwischen Experimenten zu messen. Gleichzeitig offenbart sich ein positiver Zusammenhang von Kondensationsrate mit der Distanz zwischen den Fluoreszenzmarkierungen. Diese Korrelation zeigt, dass die Kondensationsaktivität entlang des Chromosomenarms verteilt ist. Weitere Optimierung der Mikroskopkonfiguration und die Verbesserungen in der Datenverarbeitung erlauben es, die longitudinale Verkürzung der Chromosomen auf Einzelzellebene aufzulösen. Dies führt zur Beobachtung von longitudinalen Oszillationen und offenbart, dass die Kondensation linear verläuft. Schließlich etabliere ich eine verbesserte Version der Chromatin Markierung, indem ich nicht-rekombinierbare Tetracyclin Operator Wiederholungssequenzen für S. pombe adaptiere

A MAD7‐based genome editing system for Escherichia coli

Abstract A broad variety of biomolecules is industrially produced in bacteria and yeasts. These microbial expression hosts can be optimized through genetic engineering using CRISPR tools. Here, we designed and characterized such a modular genome editing system based on the Cas12a‐like RNA‐guided nuclease MAD7 in Escherichia coli. This system enables the efficient generation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or gene deletions and can directly be used with donor DNA from benchtop DNA assembly to increase throughput. We combined multiple edits to engineer an E. coli strain with reduced overflow metabolism and increased plasmid yield, highlighting the versatility and industrial applicability of this approach

Nucleosome eviction in mitosis assists condensin loading and chromosome condensation

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