Biochemische Charakterisierung und Untersuchungen der Röntgenstruktur am Molybdänspeicherprotein aus Azotobacter vinelandii

Schemberg J. Biochemische Charakterisierung und Untersuchungen der Röntgenstruktur am Molybdänspeicherprotein aus Azotobacter vinelandii. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2006.According to the current knowledge, the Mo storage protein and its tungstate containing analogue, both intensively studied in the present work, are the only proteins in nature binding polyoxomolybdate or polyoxotungstate clusters, respectively. Therefore this storage system combines the fields of biomacromolecules and inorganic supramolecules. The Mo storage protein is a part of the nitrogen fixation process in A. vinelandii accumulating large amounts of Mo inside the cell and providing, if required, Mo for the nitrogenase system. The high-capacity of Mo storage protein in combination with the high-affinity Mo transport proteins (Mo uptake into the cell) represent a system that supply Mo to the organism in sufficient amounts even at temporarily lack of Mo which thus guarantee A. vinelandii a significant competitive advantage towards other diazotrophic bacteria. Biochemical studies indicated that the release of Mo (as molybdate) from the Mo storage protein (MoSto) is strongly influenced by temperature and pH value and other factors like incubation time, protein concentration and degree of purity. A detailed pH titration (from slightly acidic to alkaline region) revealed that for the Mo release process three different Mo release steps can be distinguished. Each release step appears to be accompanied by a deprotononation of a amino acid (histidine) and/or the decomposition of polymolybdate clusters which become distinctly unstable upon increasing the high OH- concentration. The Mo release process does not require ATP but the cosubstrate prevents the Mo release or at least reduces the degree of the Mo release, respectively. Consequently, in addition to the pH value ATP plays an important role in intracellular control of Mo release. The presence of both ATP and MgCl2 is the essential prerequisite for the binding of molybdate and tungstate to the Mo storage protein respectively. The reconstitution of the holoprotein indicates a possible allosteric dependence on ATP. A corresponding tungsten-containing storage protein ("WSto") could be synthesized in-vivo as well as constructed in-vitro by a metal-ion exchange procedure based on experiments with the isolated MoSto protein. The high W content of WSto and the low yield of tungstate release strongly suggests that the W-oxide-based clusters are tighter bound to the protein than the polyoxomolybdate compounds. On the contrary to the octameric subunit composition described in an earlier publication, x-ray structure analysis of WSto revealed a heterohexamer ([alpha]3[beta]3) with a size of about 100x100x70 Å cubed 3 which can be subdivided into a trimer of [alpha][beta]-dimers adopting a threefold pseudosymmetry. Additional research by analytical ultracentrifugation and electrophoretic trials imply also higher oligomeric states in the soluble state of the protein. Furthermore, five different W(VI)-cluster types which are embedded into pockets at the surface of the protein, were identified and structurally characterized. An accurate description of these clusters is hampered by the fact that the cluster formation mostly not completely occupied and only partially synthesized so that the strong scattering of tungsten partly mask the oxygen in the electron density map.Das in der vorliegenden Arbeit untersuchte Mo-Speicherprotein und das entsprechende W-enthaltende Analogon sind nach bisherigen Erkenntnissen die einzigen Proteine, die Polyoxomolybdat- oder Polyoxowolframat-Cluster enthalten. Dieses System stellt somit eine Verknüpfung zwischen der Welt der Biomakromoleküle und der anorganischen Supramoleküle her. Das Mo-Speicherprotein ist Teil des Stickstofffixierungsprozesses, in dem es große Mengen an Molybdän innerhalb der Zelle speichert und bei Bedarf dem Nitrogenasesystem zur Verfügung stellt. Das große Fassungsvermögen des Mo-Speicherproteins in Kombination mit den hoch affinen Mo-Transportproteinen stellt ein System dar, das dem Organismus selbst bei zeitweisem Mangel an Mo ausreichende Mengen bereitstellt und ihm in der Natur damit einen Wettbewerbsvorteil gegenüber anderen diazotrophen Bakterien verschafft. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass die Freisetzung des Molybdäns (als Molybdat) aus dem Speicherprotein am stärksten durch die Temperatur und den pH-Wert, aber auch von anderen Faktoren wie der Inkubationszeit, Proteinkonzentration und dem Reinheitsgrad beeinflusst wird. Titrationen des pH-Werts (vom leicht sauren in den alkalischen Bereich) offenbarten, dass der Freisetzungsprozess in drei unterschiedlichen Stufen erfolgt, wobei jeder dieser Schritte vermutlich mit einer Deprotonierung einer Aminosäure (Histidin) und/oder dem Zerfall der bei hohen OH--Konzentrationen labilen Polymolybdat-Cluster einhergeht. Dieser Prozess benötigt zwar kein ATP, allerdings verhindert das Kosubstrat die Mo-Freisetzung und reduziert dadurch den Grad des Freisetzungsprozesses. Somit kommt dem ATP eine entscheidende Rolle bei der intrazellulären Kontrolle der Mo-Freisetzung zu. Die notwendige Voraussetzung zur Bindung von Molybdat bzw. Wolframat an das Speicherprotein ist die Anwesenheit von ATP und MgCl2. Rekonstitutionsprozesse mit dem Apoprotein zeigten eine mögliche allosterische Kosubstratabhängigkeit. Das entsprechende W-haltige Speicherprotein (WSto) konnte sowohl in vivo sowie in vitro durch eine Metallaustausch-Methode, die auf Experimenten mit isoliertem MoSto basiert, synthetisiert werden. Der hohe W-Gehalt von WSto und die geringe Freisetzungsrate von Wolfram machen deutlich, dass die W-oxid-Cluster stärker am Protein gebunden sind als im Polyoxomolybdat-System. Entgegen der früheren Publikation zeigte die Röntgenstrukturanalyse des WSto ein Heterohexamer ([alpha]3[beta]3) mit einer Größe von 100x100x70 Å hoch 3, das aus einem Trimer von [alpha][beta]-Dimeren besteht und eine 3-zählige pseudosymmetrische Anordnung einnimmt. Zusätzliche Untersuchungen durch analytische Ultrazentrifugation und Elektrophoresestudien lassen auf gleichzeitig in den Präparaten anwesende höhere oligomere Zustände schließen. Darüber hinaus konnten 5 verschiedene W(VI)-O-Cluster, die in Taschen der Oberfläche des Proteins eingebettet waren, nachgewiesen und ihre Struktur charakterisiert werden. Eine genaue Beschreibung der Cluster wurde durch die meistens nicht vollständige Besetzung und Teilsynthesen verhindert, so dass das stark streuende Wolfram die Sauerstoffatome in der Elektronendichte maskierte

Development of a microfluidic platform for the synthesis of MPI tracer materials

To avoid the disadvantages of classical batch-wise coprecipitation in the synthesis of iron oxide nanoparticles we developed a microfluidic synthesis platform with continuous flow mode which enables a faster and more efficient adjustment of relevant parameters like pH-value, temperature and educt concentration. Initial results of the electrostatically stabilized particles demonstrate the high potential for the use as tracer in magnetic particle imaging or contrast agent in magnetic resonance imaging outperforming the efficacy of the current gold-standard Resovist®.   Int. J. Mag. Part. Imag. 6(2), Suppl. 1, 2020, Article ID: 2009007, DOI: 10.18416/IJMPI.2020.200900