Caracterización in vitro de nanopartículas dirigidas a marcadores de Cancer Stem Cells en líneas celulares de cáncer microcítico de pulmón

El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. A pesar de las diferentes terapias comúnmente utilizadas para tratar el cáncer de pulmón, el pronóstico de los pacientes sigue siendo pobre. Diversos trabajos han propuesto que muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón, pueden ser promovidos por las células madre del cáncer (CSC, del inglés Cancer Stem Cell). Las CSCs son un subconjunto de células indiferenciadas con la capacidad de iniciar la formación de tumores, proliferar y diferenciarse ampliamente. Se piensa que el crecimiento y / o la recurrencia del cáncer puede estar impulsado por este grupo de células. También están involucradas en las resistencias a la radioterapia y la quimioterapia. Los sistemas de liberación de fármacos a nanoescala están evolucionando rápidamente y pueden ofrecer un enfoque innovador para superar la resistencia de las CSCs a los fármacos así como reducir la frecuencia de recidivas. Recientemente, las estrategias basadas en nanopartículas han demostrado un aumento de la eficacia terapéutica y la reducción de los efectos secundarios adversos, en comparación con los métodos terapéuticos clásicos. Varios estudios han respaldado a la bomba ABCG2, al receptor CXCR4 y al CD44 como posibles marcadores de CSC en el cáncer microcítico de pulmón. Los objetivos directos de este trabajo son determinar la presencia de estos marcadores en la superficie de las distintas líneas celulares pulmonares, estudiar la capacidad y especificidad de unión de las nanopartículas a las diferentes dianas y caracterizar la internalización de dichas nanopartículas, con el fin de desarrollar un sistema de direccionamiento de fármacos que eliminaría selectivamente las CSCs.Lung cancer is the leading cause of cancer death worldwide. Although many therapies are commonly used to treat lung cancer, the prognosis remains poor. Several studies have suggested that many types of cancer, including lung cancer, can be promoted by cancer stem cells (CSC). CSCs are a subset of undifferentiated with the ability to initiate the tumor, proliferation and differentiation. It is thought that growth and / or recurrence of cancer may be driven by this group of cells. They are also involved in drug resistance. The nanoscale drug delivery systems are evolving rapidly and can offer an innovative approach to overcome drug resistance of the CSC and reduce the frequency of recurrences. Recently, nanoparticles based strategies have demonstrated increased therapeutic efficacy and reduced adverse side effects, compared with those of traditional therapeutic methods. Several studies have supported the ABCG2 pump, the CXCR4 receptor and CD44 as potential markers of CSCs in small cell lung cancer. The objectives of this study are to determine the presence of these markers on the surface of different lung cell lines, and to study binding specificity of nanoparticles to different targets and characterizing their internalization, in order to develop a drug targeting system which selectively eliminate CSCs.Universidad de Sevilla. Máster en Investigación Médica: clínica y experimenta

Regulation of cell death receptor S-nitrosylation and apoptotic signaling by Sorafenib in hepatoblastoma cells

Nitric oxide (NO) plays a relevant role during cell death regulation in tumor cells. The overexpression of nitric oxide synthase type III (NOS-3) induces oxidative and nitrosative stress, p53 and cell death receptor expression and apoptosis in hepatoblastoma cells. S-nitrosylation of cell death receptor modulates apoptosis. Sorafenib is the unique recommended molecular-targeted drug for the treatment of patients with advanced hepatocellular carcinoma. The present study was addressed to elucidate the potential role of NO during Sorafenib-induced cell death in HepG2 cells. We determined the intra- and extracellular NO concentration, cell death receptor expression and their S-nitrosylation modifications, and apoptotic signaling in Sorafenib-treated HepG2 cells. The effect of NO donors on above parameters has also been determined. Sorafenib induced apoptosis in HepG2 cells. However, low concentration of the drug (10nM) increased cell death receptor expression, as well as caspase-8 and -9 activation, but without activation of downstream apoptotic markers. In contrast, Sorafenib (10 µM) reduced upstream apoptotic parameters but increased caspase-3 activation and DNA fragmentation in HepG2 cells. The shift of cell death signaling pathway was associated with a reduction of S-nitrosylation of cell death receptors in Sorafenib-treated cells. The administration of NO donors increased S-nitrosylation of cell death receptors and overall induction of cell death markers in control and Sorafenib-treated cells. In conclusion, Sorafenib induced alteration of cell death receptor S-nitrosylation status which may have a relevant repercussion on cell death signaling in hepatoblastoma cells.Instituto de Salud Carlos III PI13/00021Ministerio de Economía y Competitividad BFU2012-32056Consejería de Economía, Innovación, Ciencia y Empleo, Junta de Andalucía BIO-0216Consejería de Economía, Innovación, Ciencia y Empleo, Junta de Andalucía CTS-6264Consejería de Salud, Junta de Andalucía PI13/ 0002

Desarrollo de nuevos métodos para el análisis del polifosfato en células humanas

Nombre / Nom / Name Ana Apellidos / Cognoms / Surname Sarrias Giménez Dirección de correo electrónico / Adreça de correu electrònic / email address (opcional / optional) [email protected] Departamento / Departament / Department Ciencias Básicas Área de conocimiento / Àrea de coneixement / Field of knowledge Ciencias biomédicas Director/s de Tesis / Thesis supervisor/s Samuel Bru Rullo Dirección de correo electrónico director / Adreça de correu electrònic director / Supervisor/s' email address (opcional / optional) [email protected] Fecha de defensa / Data de defensa / Defense date (dd/mm/yyyy) 19/07/2023 Título / Títol / Title Desarrollo de nuevos métodos para el análisis del polifosfato en células humanas Lengua / Llengua / Language Castellano Palabras clave / Paraules clau / Key words (máx. 10) Polifosfato, PolyP, células humanas, NUDT3, purificación bioquímica, inmunofluorescencia, microscopía. Acepto la publicación del fichero de mi tesis en Internet / Accepto la publicació del fitxer de la meva tesi a Internet / I accept that my thesis file is published on the Internet (indicar sí o no / write yes or no) En el cas d’indicar NO, l’embargament serà per un màxim de 24 mesos / En caso de indicar NO, el embargo será por un máximo de 24 meses / If you indicate NO, the attachment will be for a maximum of 24 months. Si Resumen / Resum / Abstract Dar el resumen en la lengua del documento. / Escriu el resum en la llengua del document / Write the abstract in the language of the document Si la lengua del documento no es el catalán, darlo opcionalmente también en esta lengua./ Si la llengua del document no és el català, escriure opcionalment també en català / If the language of the document is not Catalan, optionally write it in Catalan as well). El polifosfato (polyP) es una molécula lineal compuesta por cientos de residuos de fosfato unidos por enlaces fosfoanhídrido. Se encuentra presente en un amplio rango de organismos, y, en humanos, posee gran variedad de funciones relacionadas con la coagulación sanguínea, la osteogénesis, el Alzheimer o el cáncer. A pesar de su importancia biológica, el estudio del polyP en humanos se enfrenta a varias barreras. En primer lugar, su concentración en mamíferos es considerablemente baja, aproximadamente mil veces inferior que en organismos unicelulares. Además, la falta de información acerca de las enzimas implicadas en la síntesis y degradación de esta molécula en células humanas dificulta su estudio. Por último, se desconoce la cantidad y localización del polyP en células humanas y los pocos estudios que hay a menudo son contradictorios, mostrando diferentes localizaciones del polyP dentro de la célula. Para poder estudiar y analizar el metabolismo del polyP en células humanas es necesario desarrollar nuevas técnicas que permitan su estudio y cuantificación. En esta tesis doctoral se presentan 3 métodos de detección: la visualización por inmunofluorescencia, la visualización in vivo mediante live cell imaging y la purificación bioquímica de la molécula. La detección por inmunofluorescencia se realizó mediante el uso del PPBD y se pudo validar la señal tanto in vitro, mediante la incubación con Ppx1, como in vivo, mediante la sobreexpresión de NUDT3. La visualización in vivo se intentó validar con la misma estrategia, pero no se pudo probar que la señal obtenida fuera específica de polyP. Por último, se procedió a la validación de todos los pasos necesarios para la purificación bioquímica, y se realizó un estudio minucioso de varios factores que podrían influir en la cuantificación del polyP purificado. A través de esta técnica, se lograron obtener niveles de polyP celular más elevados que los descritos hasta ahora en la literatura científica. Siguiendo este protocolo, se logró purificar polyP de varias líneas celulares humanas de diferentes tejidos (pulmón, cerebro, colon y mama) y se llevó a cabo un estudio de las diferentes cantidades de polyP en cada línea celular. Además, se pudo localizar el polyP mediante inmunofluorescencia, encontrando diferencias tanto en la concentración como en localización del polyP entre las diferentes líneas. Se observó que dichas diferencias correlacionan con los patrones de expresión de las polifosfatasas PRUNE1 y NUDT3. Tras esto, y para investigar las variaciones del polyP en diferentes condiciones adversas para la célula, se realizaron estudios en condiciones de privación de nutrientes, utilizando medios de cultivo con diferentes cantidades de glucosa, fosfato, y en hipoxia. Los resultados demostraron que la cantidad de polyP celular disminuye en condiciones de privación de nutrientes. Asimismo, se estudió la dinámica del polyP frente al daño al ADN, realizando estudios de viabilidad tras modificar los niveles de polyP celular y tratar las células con cisplatino. Se observó que cuando la célula tiene sus niveles de polyP reducidos, su supervivencia frente al daño al ADN se ve afectada. Finalmente, se intentó purificar polyP de tejidos de ratón mediante el protocolo previamente descrito en esta tesis, pero sin éxito. En conclusión, esta tesis presenta dos métodos para la detección de polyP en células humanas y aporta nueva información sobre el metabolismo de esta molécula en diferentes líneas celulares y diversas condiciones metabólicas

Dietary inflammatory index and all-cause mortality in large cohorts: The SUN and PREDIMED studies

[Background]: Inflammation is known to be related to the leading causes of death including cardiovascular disease, several types of cancer, obesity, type 2 diabetes, depression-suicide and other chronic diseases. In the context of whole dietary patterns, the Dietary Inflammatory Index (DII®) was developed to appraise the inflammatory potential of the diet. [Objective]: We prospectively assessed the association between DII scores and all-cause mortality in two large Spanish cohorts and valuated the consistency of findings across these two cohorts and results published based on other cohorts.[Design]: We assessed 18,566 participants in the “Seguimiento Universidad de Navarra” (SUN) cohort followed-up during 188,891 person-years and 6790 participants in the “PREvencion con DIeta MEDiterránea” (PREDIMED) randomized trial representing 30,233 person-years of follow-up. DII scores were calculated in both cohorts from validated FFQs. Higher DII scores corresponded to more proinflammatory diets. A total of 230 and 302 deaths occurred in SUN and PREDIMED, respectively. In a random-effect meta-analysis we included 12 prospective studies (SUN, PREDIMED and 10 additional studies) that assessed the association between DII scores and all-cause mortality.[Results]: After adjusting for a wide array of potential confounders, the comparison between extreme quartiles of the DII showed a positive and significant association with all-cause mortality in both the SUN (hazard ratio [HR] = 1.85; 95% CI: 1.15, 2.98; P-trend = 0.004) and the PREDIMED cohort (HR = 1.42; 95% CI: 1.00, 2.02; P-trend = 0.009). In the meta-analysis of 12 cohorts, the DII was significantly associated with an increase of 23% in all-cause mortality (95% CI: 16%–32%, for the highest vs lowest category of DII).[Conclusion]: Our results provide strong and consistent support for the hypothesis that a pro-inflammatory diet is associated with increased all-cause mortality. The SUN cohort and PREDIMED trial were registered at clinicaltrials.gov as NCT02669602 and at isrctn.com as ISRCTN35739639, respectively.Supported by the official funding agency for biomedical research of the Spanish Government, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), through grants provided to research networks specifically developed for the trial (RTIC G03/140, to R.E.; RTIC RD 06/0045, to Miguel A. Martínez-González) and through Centro de Investigación Biomédica en Red de Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBERobn), and by grants from Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC 06/2007), Fondo de Investigación Sanitaria–Fondo Europeo de Desarrollo Regional (Proyecto de Investigación (PI) 04-2239, PI 05/2584, CP06/00100, PI07/0240, PI07/1138, PI07/0954, PI 07/0473, PI10/01407, PI10/02658, PI11/01647, P11/02505, PI13/00462, PI13/00615, PI13/01090, PI14/01668, PI14/01798, PI14/01764), Ministerio de Ciencia e Innovación (Recursos y teconologia agroalimentarias(AGL)-2009-13906-C02 and AGL2010-22319-C03 and AGL2013-49083-C3-1- R), Fundación Mapfre 2010, the Consejería de Salud de la Junta de Andalucía (PI0105/2007), the Public Health Division of the Department of Health of the Autonomous Government of Catalonia, Generalitat Valenciana (Generalitat Valenciana Ayuda Complementaria (GVACOMP) 06109, GVACOMP2010-181, GVACOMP2011-151), Conselleria de Sanitat y, PI14/01764 AP; Atención Primaria (CS) 2010-AP-111, and CS2011-AP-042), and Regional Government of Navarra (P27/2011).). Drs. Shivappa and Hébert were supported by grant number R44DK103377 from the United States National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases