Papel de la conformación de la cromatina en las alteraciones transcripciones y postranscripcionales de los RNAs asociados a cromatina

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 18-04-2023Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 18-10-2024Chromatin is the context where essential processes such as transcription and DNA replication take place, making the coordination between transcription and replication machineries essential for cell viability. Alterations in chromatin conformation can generate genomic instability, being critical for the cell. In this work, we studied three scenarios of cellular stress that lead to different chromatin alterations and focused on understanding how those chromatin alterations affect the transcription and post-transcriptional modifications of chromatin-RNAs. We first worked with mouse embryonic stem cells that present a 50% reduction in histone H1 content on chromatin (H1-TKO mESCs). Histone H1 is essential for regulating chromatin compaction, and its reduction leads to open chromatin conformation. We found that H1-TKO cells display replicative defects and increased gH2AX signalling in a transcription-dependent manner. These cells show marked transcriptional alterations, being the most remarkable a widespread accumulation of noncoding transcripts bound to chromatin. Moreover, these accumulated RNAs present reduced levels of m6A modification, what affects RNAs stability on chromatin and leads to transcription-replication conflicts. The other two scenarios that we analysed were doxorubicin and 5- fluorouracil treatments. These two drugs are widely used in chemotherapy and activate p53-mediated DNA damage response. Although the two drugs have different mechanisms of action, they both affect chromatin structure. In both cases, we observed transcriptional alterations on chromatin-bound RNAs as well as the loss of m6A modification in accumulated transcripts. Our results suggest that reductions in m6A modification are a common feature of different scenarios of cellular stress. We demonstrate a link between transcription, m6A deposition, and chromatin conformation and how their alteration generates transcriptionreplication conflictsLa cromatina es el contexto donde tienen lugar procesos esenciales como la transcripción y la replicación del DNA, por lo que la coordinación entre las maquinarias de transcripción y replicación es esencial para la viabilidad celular. Alteraciones en la conformación de la cromatina pueden generar inestabilidad genómica, siendo críticas para la célula. En este trabajo, estudiamos tres escenarios de estrés celular que conducen a diferentes alteraciones de la cromatina y nos centramos en entender cómo esas alteraciones de la cromatina afectan a la transcripción y a las modificaciones post-transcripcionales de los RNAs asociados a cromatina. En primer lugar, trabajamos con células madre embrionarias de ratón que presentan una reducción del 50% en el contenido de histona H1 en cromatina (H1-TKO mESCs). La histona H1 es esencial para regular la compactación de la cromatina, y su reducción conduce a una conformación más abierta de la misma. Encontramos que las células H1-TKO muestran defectos replicativos y aumentan la señal de gH2AX de forma dependiente de la transcripción. Estas células muestran marcadas alteraciones transcripcionales, siendo la más notable una acumulación generalizada de tránscritos no codificantes unidos a la cromatina. Además, estos RNAs acumulados presentan niveles reducidos de la modificación m6A, lo que afecta a la estabilidad de los RNAs sobre la cromatina y conduce a conflictos transcripción-replicación. Los otros dos escenarios que analizamos fueron los tratamientos con doxorrubicina y 5-fluorouracilo. Estos dos fármacos se utilizan ampliamente en quimioterapia y activan la respuesta al daño del DNA mediada por p53. Aunque los dos fármacos tienen mecanismos de acción diferentes, ambos afectan a la estructura de la cromatina y, en ambos casos, observamos alteraciones transcripcionales en los RNAs asociados a cromatina, así como la pérdida de la modificación m6A en los tránscritos acumulados. Nuestros resultados sugieren que las reducciones en la modificación m6A son una característica común de diferentes escenarios de estrés celular. De esta manera, demostramos un vínculo entre la transcripción, la deposición de m6A y la conformación de la cromatina y cómo su alteración genera conflictos transcripción-replicaciónThis work was supported by a pre-doctoral fellowship (FPI2017: BES-2017-079897) from the Ministerio de Economía, Industria y Competitividad - Agencia Estatal de Investigación associated to the project BFU2016-78849-P, co-funded by FEDER funds. The work was also funded by the project PID2019-105949GB-I00 / AEI / 10.13039/50110001103