Intracellular pathways involved in cell survival are deregulated in mouse and human spinal muscular atrophy motoneurons

Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a severe neuromuscular disorder caused by loss of the Survival Motor Neuron 1 gene (SMN1). Due to this depletion of the survival motor neuron (SMN) protein, the disease is characterized by the degeneration of spinal cord motoneurons (MNs), progressive muscular atrophy, and weakness. Nevertheless, the ultimate cellular and molecular mechanisms leading to cell loss in SMN-reduced MNs are only partially known. We have investigated the activation of apoptotic and neuronal survival pathways in several models of SMA cells. Even though the antiapoptotic proteins FAIM-L and XIAP were increased in SMA MNs, the apoptosis executioner cleaved-caspase-3 was also elevated in these cells, suggesting the activation of the apoptosis process. Analysis of the survival pathway PI3K/Akt showed that Akt phosphorylation was reduced in SMA MNs and pharmacological inhibition of PI3K diminished SMN and Gemin2 at transcriptional level in control MNs. In contrast, ERK phosphorylation was increased in cultured mouse and human SMA MNs. Our observations suggest that apoptosis is activated in SMA MNs and that Akt phosphorylation reduction may control cell degeneration, thereby regulating the transcription of Smn and other genes related to SMN function.This work was supported by grants from Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias, Unión Europea, Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) “Una manera de hacer Europa” (PI17/00231 and PI20/00098) to RMS and AG; CERCA Program/Generalitat de Catalunya; and Spanish Agency of Research (Agencia Estatal de Investigacion-PID2019- 107286RB-I00) and CIBERNED to JXC. AS holds a fellowship from Universitat de Lleida and SdF holds a fellowship from “Ajuts de Promoció de la Recerca en Salut” (IRBLleida-Diputació de Lleida). We thank Elaine Lilly, PhD, for English language revision of the paper

Survival motor neuron protein and neurite degeneration are regulated by Gemin3 in spinal muscular atrophy motoneurons

Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a genetic neuromuscular disorder caused by reduction of the ubiquitously expressed protein Survival Motor Neuron (SMN). Low levels of SMN impact on spinal cord motoneurons (MNs) causing their degeneration and progressive muscle weakness and atrophy. To study the molecular mechanisms leading to cell loss in SMN-reduced MNs, we analyzed the NF-κB intracellular pathway in SMA models. NF-κB pathway activation is required for survival and regulates SMN levels in cultured MNs. Here we describe that NF-κB members, inhibitor of kappa B kinase beta (IKKβ), and RelA, were reduced in SMA mouse and human MNs. In addition, we observed that Gemin3 protein level was decreased in SMA MNs, but not in non-neuronal SMA cells. Gemin3 is a core member of the SMN complex responsible for small nuclear ribonucleoprotein biogenesis, and it regulates NF-κB activation through the mitogen-activated protein kinase TAK1. Our experiments showed that Gemin3 knockdown reduced SMN, IKKβ, and RelA protein levels, and caused significant neurite degeneration. Overexpression of SMN increased Gemin3 protein in SMA MNs, but did not prevent neurite degeneration in Gemin3 knockdown cells. These data indicated that Gemin3 reduction may contribute to cell degeneration in SMA MNs.This work was supported by grants from Instituto de Salud Carlos III, PI20/00098 y cofinanciado por la Unión Europea, Fundació La Marató TV3 (202005-30), and CERCA Program/Generalitat de Catalunya. Research fellowships have been awarded to AG by the Generalitat de Catalunya (Serra Hunter Fellowship), to AS and MB by IRBLleida-Diputació de Lleida (Grants for the Promotion of Health Research), and to MPM by the Department of Research and Universities, Generalitat de Catalunya, with funds provided by the European Union (Training grants for predoctoral researchers, FI 2022)

Understanding the intracellular mechanisms leading to motoneuron degeneration in spinal muscular atrophy disease

L’Atròfia Muscular Espinal (AME) és una malaltia neuromuscular degenerativa greu i la primera causa genètica de mort infantil. L’AME s’origina per la pèrdua o mutació del gen Survival Motor Neuron 1 (SMN1) i la disminució de la proteïna Survival Motor Neuron (SMN). Els nivells de SMN contribueixen en la determinació del fenotip i la gravetat de la malaltia. Una duplicació centromèrica d’aquest gen, SMN2, és la responsable de la producció de proteïna SMN en la condició d’AME. La disminució sistèmica de SMN resulta en l’afectació de diversos teixits i cèl·lules. Les motoneurones (MNs) de la medul·la espinal son el tipus cel·lular amb majors alteracions. Per desenvolupar noves estratègies terapèutiques que evitin la degeneració de les MNs i la progressió de la malaltia, és necessari conèixer en profunditat els mecanismes cel·lulars que s’hi troben implicats. L’objectiu del present treball ha estat analitzar les alteracions de les vies de senyalització de supervivència neuronal PI3K/Akt i ERK MAPK, així com l’estudi de marcadors d’apoptosi i d’autofàgia en diferents models d’AME, centrant la investigació en la implicació d’aquestes modificacions en les MNs. Els resultats van mostrar que les MNs dels models d’AME presentaven un increment en la degeneració neurítica, la disminució de la supervivència cel·lular, un augment del tall de la proteasa caspassa-3 i major presència de nuclis amb morfologia apoptòtica. Les proteïnes antiapoptòtiques FAIM i XIAP estaven disminuïdes en extractes totals de medul·la espinal de ratolí d’AME, tanmateix, en cultius de MNs es trobaven augmentades. Tot i així, la presència de caspassa-3 activa i de nuclis fragmentats, indica que l’expressió de FAIM-L i XIAP podria no ser suficient per contrarestar l’activació de l’apoptosi en MNs. Les vies de senyalització intracel·lular PI3K/Akt i ERK MAPK també estan alterades en les MNs AME. Es va observar una disminució de la fosforilació d’Akt i un increment de la fosforilació d’ERK. La inhibició d’aquestes vies en MNs va demostrar la seva implicació en la regulació transcripcional de SMN. Tot i així, la regulació endògena de SMN no va alterar la fosforilació d’Akt i ERK. L’estudi dels marcadors d’autofàgia va revelar un perfil d’expressió diferencial de les proteïnes analitzades entre els models cel·lulars d’AME. Així doncs, mentre que en múscul hi havia una disminució de la formació d’autofagosomes i un augment del flux d’autofàgia, en les MNs s’observava un increment d’autofagosomes i una disminució del flux. A més, les MNs AME presentaven un increment en la fosforilació de la proteïna mTOR, la qual participa en la inhibició de l’autofàgia. La fosforilació de mTOR i els canvis dels indicadors de l’autofàgia poden ser modulats per la inhibició farmacològica de la via ERK i per quelants de Ca2+ intracel·lular. En conclusió, els nostres resultats demostren alteracions en vies de supervivència intracel·lular, en la senyalització per Ca2+, i en els processos d’autofàgia i apoptosi en les MNs AME. Les observacions d’aquest treball suggereixen una connexió entre els nivells de Ca2+ intracel·lular i la disrupció de la via ERK MAPK, l’activació de la qual contribueix a la modificació de l’autofàgia en les MNs AME. La regulació del Ca2+ intracel·lular i de la via ERK MAPK podrien constituir dianes per restaurar els processos d’autofàgia alterats en les MNs i ser considerades en el desenvolupament futur de noves teràpies combinades pel tractament de l’AME.La Atrofia Muscular Espinal (AME) es una enfermedad neuromuscular degenerativa grave y la primera causa genética de muerte infantil. Se origina por la pérdida o mutación del gen Survival Motor Neuron 1 (SMN1) y la disminución de la proteína Survival Motor Neuron (SMN). Los niveles de SMN contribuyen a la determinación del fenotipo y la gravedad de la enfermedad. La duplicación centromérica de este gen, SMN2, es el responsable de la producción de proteína SMN en la AME. La reducción sistémica de SMN resulta en la afectación de varios tejidos y células. Las motoneuronas (MNs) de la médula espinal son el tipo celular con mayores alteraciones. Para desarrollar nuevas terapias que impidan la degeneración de las MNs y la progresión de la enfermedad, es necesario conocer en profundidad los mecanismos celulares implicados en ésta. El objetivo de éste trabajo ha sido analizar las alteraciones de las vías de señalización de supervivencia neuronal PI3K/Akt y ERK MAPK, así como el estudio de marcadores de apoptosis y de autofagia en diferentes modelos de AME, centrando la investigación en la implicación de estas modificaciones en las MNs. Los resultados mostraron que las MNs de los modelos de AME presentaban incremento en la degeneración neurítica, disminución en la supervivencia celular, aumento del corte de la proteasa caspasa-3 y mayor presencia de núcleos apoptóticos. Las proteínas antiapoptóticas FAIM y XIAP estaban reducidas en extractos totales de médula espinal de ratón de AME, mientras que en cultivos de MNs se encontraban elevadas. Aun así, la presencia de caspasa-3 activa y de núcleos fragmentados indica que la expresión de FAIM-L y XIAP podría ser insuficiente para contrarrestar la activación de la apoptosis en las MNs AME. Las vías de señalización PI3K/Akt y ERK MAPK también están alteradas en las MNs AME. Se observó una disminución de la fosforilación de Akt y un incremento de la fosforilación de ERK. La inhibición de estas vías en MNs demostró su implicación en la regulación transcripcional de SMN. No obstante, la regulación endógena de SMN no alteró la fosforilación de Akt y ERK. El estudio de los marcadores de autofagia reveló una expresión diferencial de las proteínas analizadas entre los modelos celulares de AME. Mientras que en músculo había una disminución de la formación de autofagosomas y un aumento del flujo de autofagia, en las MNs se observaba un incremento de autofagosomas y una disminución del flujo. Además, las MNs AME presentaban un incremento en la fosforilación de la proteína mTOR, la cual participa en la inhibición de la autofagia. La fosforilación de mTOR y los cambios de los indicadores de la autofagia pueden ser modulados por la inhibición farmacológica de la vía ERK y por quelantes de Ca2+ intracelular. En conclusión, nuestros resultados demuestran alteraciones en vías de supervivencia intracelular, en la señalización por Ca2+, y en los procesos de autofagia y apoptosis en las MNs AME. Las observaciones de este trabajo sugieren una conexión entre los niveles de Ca2+ intracelular y la disrupción de la vía ERK MAPK, la activación de la cual contribuye a la modificación de la autofagia en las MNs AME. La regulación del Ca2+ intracelular y de la vía ERK MAPK podrían constituir dianas para restaurar los procesos de autofagia alterados en las MNs y ser consideradas en el futuro desarrollo de nuevas terapias combinadas para el tratamiento de la AME.Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a severe degenerative neuromuscular disease and the first genetic cause of infant death. SMA is caused by the loss or mutation of the Survival Motor Neuron 1 gene (SMN1) and the decrease of the Survival Motor Neuron (SMN) protein. SMN levels contribute to determining the disease phenotype and severity. A centromeric duplication of this gene, SMN2, is responsible for SMN protein production in SMA condition. The systemic decrease of SMN results in the alteration of various cells and tissues. Spinal cord motoneurons (MNs) are the cells with greatest dysregulations in SMA disease. To develop new therapeutic strategies for preventing MN degeneration and disease progression, studying the cellular and molecular mechanisms underlying the collapse of these cells is needed. The objectives of this work have been to analyze the alterations of the neuronal survival signaling pathways PI3K/Akt and ERK MAPK, as well as the study of apoptosis and autophagy markers in different SMA models, focusing the investigation on the involvement of these modifications in MNs. Results showed that mouse and human SMA MNs showed higher percentage of neurite degeneration, decreased cell survival, increased caspase-3 cleavage, and incremented presence of nuclei with apoptotic morphology. The antiapoptotic proteins FAIM-L and XIAP were reduced in total extracts of SMA spinal cord. Conversely, in cultured MNs they were increased. However, the presence of active caspase-3 and fragmented nuclei indicates that FAIM-L and XIAP expression may not be sufficient to counteract apoptosis activation in SMA MNs. The intracellular signaling pathways PI3K/Akt and ERK MAPK are also altered in SMA MNs. A decrease in Akt phosphorylation and an increase in ERK phosphorylation was observed. The inhibition of these pathways in MNs demonstrated their involvement in SMN protein transcription. However, SMN endogenous regulation did not alter Akt or ERK phosphorylation. The study of autophagy markers revealed a differential expression profile of the analyzed proteins between SMA cellular models. Hence, while in muscle there was a decrease in autophagosome formation and an increase in autophagic flux, in MNs there was an increase in autophagosomes and a decrease in flux. In addition, SMA MNs showed increased mTOR phosphorylation, a protein which participates in autophagy inhibition. mTOR phosphorylation and changes in autophagy markers can be modulated by ERK MAPK pathway pharmacological inhibition and intracellular Ca2+ chelators. In conclusion, our results demonstrate alterations in intracellular survival pathway, in Ca2+ signaling, and in autophagy and apoptosis processes in SMA MNs. This work’s observations suggest a connection between intracellular Ca2+ levels and the disruption of the ERK MAPK pathway, the activation of which contributes to the modification of autophagy in SMA MNs. Intracellular Ca2+ and ERK MAPK pathway regulation could constitute targets to restore altered autophagic processes in MNs and may be considered in the future development of new combined therapies for SMA treatment