Dual effect of the SR proteins ASF/SF2, SC35 and 9G8 on HIV-1 RNA splicing and virion production

In HIV-1 infected cells transcription of the integrated provirus generates the single full length 9 kb viral RNA, a major fraction of which is spliced to produce the single-spliced 4 kb RNAs and the multiple-spliced 2 kb RNAs. These spliced RNAs are the messengers for the Env glycoproteins and the viral regulatory factors. The cellular SR and hnRNP proteins were shown in vitro to control alternative splicing by binding cis-regulatory elements on the viral RNA. To better understand in vivo the role of the SR proteins on HIV-1 genomic RNA splicing and virion production, we used a human cell line expressing high levels of complete HIV-1 and either one of the ASF/SF2, SC35, and 9G8 SR proteins. Results show that over-expressing SR proteins caused a large reduction of genomic RNA and that each SR protein modified the viral 9 kb RNA splicing pattern in a specific mode. In fact, ASF/SF2 increased the level of Vpr RNA while SC35 and 9G8 caused a large increase in Tat RNA. As expected, overexpressing SR proteins caused a strong reduction of total Gag made. However, we observed by immuno-confocal microscopy an accumulation of Gag at the plasma membrane and in intracellular compartments while there is a dramatic reduction of Env protein made in most cells. Due to the negative impact of the SR proteins on the levels of genomic RNA and HIV-1 structural proteins much less virions were produced which retained part of their infectivity. In conclusion, SR proteins can down-regulate the late steps of HIV-1 replication

Dual effect of the SR proteins ASF/SF2, SC35 and 9G8 on HIV-1 RNA splicing and virion production

In HIV-1 infected cells transcription of the integrated provirus generates the single full length 9 kb viral RNA, a major fraction of which is spliced to produce the single-spliced 4 kb RNAs and the multiple-spliced 2 kb RNAs. These spliced RNAs are the messengers for the Env glycoproteins and the viral regulatory factors. The cellular SR and hnRNP proteins were shown in vitro to control alternative splicing by binding cis-regulatory elements on the viral RNA. To better understand in vivo the role of the SR proteins on HIV-1 genomic RNA splicing and virion production, we used a human cell line expressing high levels of complete HIV-1 and either one of the ASF/SF2, SC35, and 9G8 SR proteins. Results show that over-expressing SR proteins caused a large reduction of genomic RNA and that each SR protein modified the viral 9 kb RNA splicing pattern in a specific mode. In fact, ASF/SF2 increased the level of Vpr RNA while SC35 and 9G8 caused a large increase in Tat RNA. As expected, overexpressing SR proteins caused a strong reduction of total Gag made. However, we observed by immuno-confocal microscopy an accumulation of Gag at the plasma membrane and in intracellular compartments while there is a dramatic reduction of Env protein made in most cells. Due to the negative impact of the SR proteins on the levels of genomic RNA and HIV-1 structural proteins much less virions were produced which retained part of their infectivity. In conclusion, SR proteins can down-regulate the late steps of HIV-1 replication

Analyse discriminante de la sévérité de l'allergie à l'arachide

International audienceL'allergie à l'arachide est un problème de santé publique. La sévérité des réactions, parfois très graves, est évaluée par un score lors d'un Test de Provocation Orale (TPO), qui nécessite l'hospitalisation du patient, souvent un enfant, et peut s'avérer dangereux. Afin de s'en affranchir, ont été réalisées des analyses discriminantes concernant trois mesures de la sévérité de l'allergie à l'arachide : le score du TPO, la dose réactogène et le score de sévérité du premier accident, à partir de 2 groupes de variables explicatives par patient ($n=93$) : 6 dosages immunologiques et 30 tests cutanés. Une Analyse Factorielle Multiple a été implémentée afin d'équilibrer l'influence des deux groupes de variables sur les modèles prédictifs, avec les règles de classement linéaire et quadratique, les $k$-NN, CART, et AdaBoost, précédés par une phase de sélection de variables et testés par validation croisée. De plus, un algorithme permettant simultanément de regrouper les doses réactogènes en classes et de sélectionner les caractères discriminants est proposé

Tests multiples pour la comparaison des probabilités de survenue d'une infidélité de transcription dans des ARNm sains et cancéreux

International audienceL'implication d'erreurs de transcription dans l'hétérogénéité du cancer avait jusqu'alors été peu considérée. En effet, la transcription est supposée fidèle et contrôlée par un système complexe de vérification. Afin d'étudier l'hétérogénéité des séquences d'ARNm issus de tissus sains et cancéreux de 17 gènes d'intérêt, les probabilités de survenue d'une substitution de base ont été comparées à chaque position des séquences des transcrits à l'aide d'une procédure de tests multiples. Pour cela, les séquences Expressed Sequences Tags, qui sont des copies partielles des ARNm d'un gène, ont été utilisées et un modèle prenant en compte l'erreur de séquençage inhérente à ces données a été proposé. Enfin, l'estimateur Location Based Estimator du nombre moyen de tests faux positifs a été étendu au cas de statistiques de tests discrètes. Cette étude préliminaire a ainsi permis de mettre en évidence les positions des ARNm plus fréquemment sujettes à des substitutions dans les tissus cancéreux que dans les tissus sains et d'introduire la notion d'infidélité de transcription chez l'Homme

Etude de la régulation de l'epissage du transcrit primaire du virus de l'immunodéficience humaine de type I

L'une des étapes clefs de la multiplication des rétrovirus est l'expression des gènes viraux à partir de l'ADN proviral intégré dans le génome de la cellule hôte. Le transcrit primaire unique synthétisé à partir de l'ADN proviral par l'ARN polymérase de la cellule hôte doit, à la fois, rester intact pour servir d'ARN génomique pour les nouveaux virions et être épissé pour servir d'ARN messager pour la production des protéines nécessaires au développement viral. La survie et la multiplication virales passent donc par un équilibre précis entre ARN épissé et ARN non épissé, équilibre qui dépend de l'expression de la protéine virale Rev. L'épissage du transcrit primaire du virus BIV-1 est un processus très complexe du fait de l'existence de 4 sites donneurs et de 8 sites accepteurs d'épissage, dont l'utilisation en combinaison permet la synthèse d'une quarantaine d'ARN différents. Des travaux antérieurs du laboratoire et de l'équipe de K. Beemon (USA) montraient que les choix d'épissage reposent essentiellement sur la nature sous-optimale des sites accepteurs. Le but de notre travail a été d'étudier les bases moléculaires régissant les choix alternatifs d'utilisation de ces sites accepteurs. La structure secondaire de l'ARN est un paramètre susceptible de moduler l'efficacité des sites d'épissage. Afin de tester l'effet de ce paramètre dans le cas du virus BIV-1, nous avons mené une étude expérimentale sur la structure secondaire de l'ARN de ce virus autour des sites accepteurs A2, A3 à A5 et A7. Cette étude a révélé un fort degré de structuration de l'ARN et nous avons pu montrer qu'aussi bien in vitro qu' in vivo l'appariement de bases impliquant la séquence polypyrimidine du site A3 module l'efficacité d'utilisation de ce site, ceci du fait du caractère sous-optimal de cette séquence polypyrimidine. L'efficacité d'utilisation des sites accepteurs d'épissage est également liée à l'existence, à leur voisinage, de séquences régulatrices agissant en cis, dont le rôle est, en général, de fixer des facteurs protéiques agissant en trans. Ainsi, nous avons étudié une séquence intronique inhibant l'utilisation du site A2 in vitro, qui avait été découverte précédemment au laboratoire. L'action de cette séquence pourrait expliquer l'élimination couplée de l'intronD2-A2 avec un intron aval renfermant le site D3, qui est observée in vivo. Nous avons délimité cette séquence est montré qu'elle avait une architecture modulaire. Nous avons également découvert une nouvelle séquence exonique qui limite l'utilisation du site A3 in vitro et in vivo et nous avons montré qu'elle fixe la protéine hnRNP H. Des substitutions de bases dans cette séquence peuvent soit affaiblir son effet inhibiteur, soit l'augmenter et, dans ce cas, nous avons montré qu'il y avait fixation de la protéine hnRNP A1. Cette séquence correspond à une des régions de l'ARN du virus BIV-1 subissant un processus d'édition dans des cellules chroniquement infectées. Nos résultats indiquent que la modification générée par l'édition diminue fortement l'épissage au site A3 ; ce qui doit limiter la production de protéine Tat, toxique pour la cellule hâte. Enfin, nous avons pu montrer que l'utilisation des sites d'épissage de l'ARN du virus BIV-1 est activée de façon différentielle par les protéines SR SC35 et ASF/SF2, dont le taux relatif d'expression varie au cours de l'infection virale. Ainsi, la régulation complexe de l'épissage de l'ARN du virus BIV-1 dépend de la structuration de l'ARN, de séquences régulatrices, de facteurs agissant en trans et ces régulations semblent être la cible de mécanismes de résistance de la cellule.NANCY1-SCD Sciences & Techniques (545782101) / SudocSudocFranceF

A Second Exon Splicing Silencer within Human Immunodeficiency Virus Type 1 tat Exon 2 Represses Splicing of Tat mRNA and Binds Protein hnRNP H

International audienceAn equilibrium between spliced and unspliced primary transcripts is essential for retrovirus multiplication. This equilibrium is maintained by the presence of inefficient splice sites. The A3 3'-splice site of human immunodeficiency virus type I (HIV-1) is required for Tat mRNA production. The infrequent utilization of this splice site has been attributed to the presence of a suboptimal polypyrimidine tract and an exonic splicing silencer (ESS2) in tat exon 2 approximately 60 nucleotides downstream of 3'-splice site A3. Here, using site-directed mutagenesis followed by analysis of splicing in vitro and in HeLa cells, we show that the 5' extremity of tat exon 2 contains a second exonic splicing silencer (ESS2p), which acts to repress splice site A3. The inhibitory property of this exonic silencer was active when inserted downstream of another HIV-1 3'-splice site (A2). Protein hnRNP H binds to this inhibitory element, and two U-to-C substitutions within the ESS2p element cause a decreased hnRNP H affinity with a concomitant increase in splicing efficiency at 3'-splice site A3. This suggests that hnRNP H is directly involved in splicing inhibition. We propose that hnRNP H binds to the HIV-1 ESS2p element and competes with U2AF(35) for binding to the exon sequence flanking 3'-splice site A3. This binding results in the inhibition of splicing at 3'-splice site A3

Differential effects of the SR proteins 9G8, SC35, ASF/SF2, and SRp40 on the utilization of the A1 to A5 splicing sites of HIV-1 RNA

Splicing is a crucial step for human immunodeficiency virus, type 1 (HIV-1) multiplication; eight acceptor sites are used in competition to produce the vif, vpu, vpr, nef, env, tat, and rev mRNAs. The effects of SR proteins have only been investigated on a limited number of HIV-1 splicing sites by using small HIV-1 RNA pieces. To understand how SR proteins influence the use of HIV-1 splicing sites, we tested the effects of overproduction of individual SR proteins in HeLa cells on the splicing pattern of an HIV-1 RNA that contained all the splicing sites. The steady state levels of the HIV-1 mRNAs produced were quantified by reverse transcriptase-PCR. For interpretation of the data, transcripts containing one or several of the HIV-1 acceptor sites were spliced in vitro in the presence or the absence of one of the tested SR proteins. Both in vivo and in vitro, acceptor sites A2 and A3 were found to be strongly and specifically regulated by SR proteins. ASF/SF2 strongly activates site A2 and to a lesser extent site A1. As a result, upon ASF/SF2 overexpression, the vpr mRNA steady state level is specifically increased. SC35 and SRp40, but not 9G8, strongly activate site A3, and their overexpression ex vivo induces a dramatic accumulation of the tat mRNA, to the detriment of most of the other viral mRNAs. Here we showed by Western blot analysis that the Nef protein synthesis is strongly decreased by overexpression of SC35, SRp40, and ASF/SF2. Finally, activation by ASF/SF2 and 9G8 was found to be independent of the RS domain. This is the first investigation of the effects of variations of individual SR protein concentrations that is performed ex vivo on an RNA containing a complex set of splicing sites

Anaphylaxis to Yuzu (Citrus junos)

International audienc