Estudo da interação da RIF com bicamadas lipídicas

Após administração oral um fármaco tem de ultrapassar várias barreiras antes de chegar ao sistema circulatório. Para além do efeito na sua absorção, a distribuição, metabolismo e eliminação (ADME) do fármaco também envolve a interação e/ou permeação através de membranas biológicas. Também a eficácia no local alvo envolve frequentemente interações com a membrana biológica, quer via direta no caso de medicamentos ativos na membrana, quer indiretamente através do aumento ou diminuição da concentração local disponível para interagir com o alvo terapêutico. As membranas biológicas são formadas por uma bicamada lipídica contínua com proteínas incorporadas ou adsorvidas na superfície polar. A barreira de difusão que limita a permeabilidade dos fármacos através da membrana biológica é dada pela bicamada lipídica. Para a maioria dos medicamentos (hidrofóbicos e amfifilicos) as interações não especificas também são estabelecidas com a bicamada lipídica da membrana biológica. Por conseguinte, é importante caracterizar as interações estabelecidas entre o fármaco e sistemas modelo que mimetizem a porção da bicamada lipídica da membrana biológica, bem como o efeito do fármaco nas propriedades da bicamada. Vesículas unilamelares largas (LUV’S) são sistemas modelo excelentes, uma vez que são estáveis e podem ser preparados com composições distintas de lípidos que mimetizem as propriedades relevantes da membrana biológica (nomeadamente as suas propriedades dinâmicas e electroestáticas) Neste trabalho caraterizámos as interações da Rifampicina (RIF) com LUV’S preparados com POPC puro (mimetizando as membranas em geral) e a partir de uma mistura de POPE:POPC:POPG a 50:30:20 molar % (como um modelo de uma membrana bacteriana). A Rifampicina é um antibiótico amplamente usado na tratamento da tuberculose, atuando na inibição da síntese do RNA dependente do DNA causando a destruição das células bacterianas. A interação da RIF com a bicamada lipídica foi estudada através de calorimetria de titulação isotérmica (ITC), com a caracterização do coeficiente de partição e a variação da entalpia associada para diferentes concentrações locais do fármaco, mudanças no estado de ionização da RIF devido à interação com a bicamada lipídica, e informação qualitativa sobre a velocidade de permeação através da bicamada. Um ensaio preliminar para determinar o coeficiente de partição foi efetuado utilizando espectroscopia de absorção UV/Visível. Variações nas propriedades da bicamada lipídica devido à presença de diferentes concentrações locais de RIF foram avaliadas por dispersão dinâmica de luz e através do efeito na velocidade de permeação da carboxifluoresceína. A Rifampicina é um antibiótico amplamente usado na tratamento da tuberculose, atuando na inibição da síntese do RNA dependente do DNA causando a destruição das células bacterianas. A interação da RIF com a bicamada lipídica foi estudada através de calorimetria de titulação isotérmica (ITC), com a caracterização do coeficiente de partição e a variação da entalpia associada para diferentes concentrações locais do fármaco, mudanças no estado de ionização da RIF devido à interação com a bicamada lipídica, e informação qualitativa sobre a velocidade de permeação através da bicamada. Um ensaio preliminar para determinar o coeficiente de partição foi efectuado utilizando espectroscopia de absorção UV/Visível. Variações nas propriedades da bicamada lipídica devido à presença de diferentes concentrações locais de RIF foram avaliadas por espalhamento dinâmico de luz e através do efeito da velocidade de permeação da carboxifluoresceína

Interaction of Hoechst 33342 with POPC Membranes at Different pH Values

Hoechst 33342 (H33342) is a fluorescent probe that is commonly used to stain the DNA of living cells. To do so, it needs to interact with and permeate through cell membranes, despite its high overall charge at physiological pH values. In this work, we address the effect of pH in the association of H33342 with lipid bilayers using a combined experimental and computational approach. The partition of H33342 to 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) lipid membranes was experimentally quantified using fluorescence spectroscopy and isothermal titration calorimetry (ITC) measurements. Quantum chemical calculations were performed to select the most stable isomer of H33342 for the overall charges 0, +1, and +2, expected to predominate across the 5 < pH < 10 range. The interaction of these isomers with POPC bilayers was then studied by both unrestrained and umbrella sampling molecular dynamics (MD) simulations. Both experimental results and computational free energy profiles indicate that the partition coefficient of H33342 displays a small variation over a wide pH range, not exceeding one order of magnitude. The enthalpy variation upon partition to the membrane suggests efficient hydrogen bonding between the probe and the lipid, namely, for the protonated +2 form, which was confirmed in the MD simulation studies. The relatively high lipophilicity obtained for the charged species contrasts with the decrease in their general hydrophobicity as estimated from octanol/water partition. This highlights the distinction between lipophilicity and hydrophobicity, as well as the importance of considering the association with lipid bilayers when predicting the affinity for biomembranes