Purification and characterization of β-glucosidases from Penicillium chrysogenum and their application in supplementation of enzymatic cocktails for biomass hydrolysys

β-glicosidases tem recebido atenção em vários campos por causa de suas aplicações práticas. Assim, os objetivos deste trabalho foram estabelecer as condições de cultivo de P. chrysogenum em meio liquido contendo farelo de trigo como fonte de carbono, purificar e caracterizar as β-glicosidases secretadas. O sobrenadante da cultura foi submetido a precipitação por sulfato de amônio e cromatografia de interação hidrofóbica. Duas β-glicosidases foram encontradas, PcβGlu1 e PcβGlu2. Para melhor purificação PcβGlu2 foi submetida à cromatografia de exclusão molecular. PcβGlu1 demonstrou ser mais estável que PcβGlu2 quando colocada a altas temperaturas e as duas apresentaram atividade ótima em pH 5,0. PcβGlu1 e PcβGlu2 possuem massas moleculares nativas de 241 kDa e 95 kDa, respectivamente. A determinação da configuração do carbono anomérico demonstrou que as enzimas atuam sobre seus substratos pelo mecanismo de retenção de configuração. A atividade de PcβGlu2 foi mais inibida pelos íons Cu 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ e Hg + a 10 mM que PcβGlu1. PcβGlu1 demonstrou cinética Micheliana para todos os substratos testados com valores de K M variando de 0.09 ± 0.01 (laminarina) a 1.7 ± 0.1 mM (C2). PcβGlu2 demonstrou inibição pelos substratos MUβGli, pNPβGli, celodextrinas (C3, C4 and C5), octilβGli e Lb, com valores de K M variando de 0.014 ± 0.001 (MUGβGli) a 0.64 ± 0.06 mM (Cb). As duas enzimas foram inibidas de forma competitiva por glicose e de acordo com um modelo de inibição mista por celobiose quando pNPβGli foi utilizado como substrato, sendo PcβGlu2 mais inibida que PcβGlu1. PcβGlu1 foi identificada com 15% de cobertura como produto codificado pelo gene Pc18g01940 e PcβGlu2 foi identificada como produto codificado pelo gene 20g10170 com 3,5 % de cobertura. As duas enzimas possuem maiores afinifidade de ligação para resíduos de glicose nos subsítios -1 e +1. Comparando as duas enzimas, PcβGlu2 possui maior potencial para aplicação em hidrólise de biomassa, visto que foi capaz de hidrolisar biomassas sem a adição de enzimas suplementares.β-glucosidases have received attention in many fields, mainly because of their practical applications. The objectives of this work were to stablish the best conditions for P. chrysogenum cultivation in submerged culture containing wheat bran as carbon source and the purification and characterization of β-glucosidases found. The culture supernatant was subjected to ammonium sulphate precipitation and hydrophobic interaction chromatography. Two β-glucosidases were found, PcβGlu1 and PcβGlu2. For further purification, PcβGlu2 was subjected to gel filtration chromatography. PcβGlu1 was more stable than PcβGlu2 when subjected to high temperatures and both have optimum activity at pH 5.0. PcβGlu1 and PcβGlu2 have respective native molecular masses of 241 kDa and 95 kDa (gel filtration). The determination of anomeric carbon configuration demonstrates that enzymes hydrolyze their substrates with retention of configuration. The PcβGlu2 activity was more inhibited for Cu 2+ , Mg 2+ , Zn 2+ e Hg + at 10 mM than PcβGLu1. PcβGlu1 showed Michaelian-Menten kinetics for all substrates tested with K M values ranging from 0.09 ± 0.01 (laminarin) to 1.7 ± 0.1 mM (C2). PcβGlu2 showed substrate inhibition for MUβGlu, pNPβGlu, cellodextrins (C3, C4 and C5), octilβGlu and Lb, with K M values ranging from 0.014 ± 0.001 (MUβGlu) to 0.64 ± 0.06 mM (Cb). Glucose is competitive inhibitor and celobiose is a mixed-type inhibitor of PcβGlu1 and PcβGlu2 when pNPβGlu is used as substrate. PcβGlu2 was more inhibited than PcβGlu1for both inhibitors. PcβGlu1 was identified with 15% of coverage as the product coded by the gene Pc18g01940 and PcβGlu2 was identified as as the product coded by the gene Pc20g10170 with 3,5 % of coverage. The two enzymes bind glucosyl residues with more affinity at -1 and +1 subsites. Comparing the two enzymes PcβGlu2 has more pontetial to be applied on biomass hydrolysis because it was able to hydrolyse several sources of biomass without addition of supplementary enzymes.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Caracterização de α-glicosidases de Lutzomyia longipalpis: atividades enzimáticas, expressão gênica e modulação por Leishmania mexicana

Submitted by Repositório Arca ([email protected]) on 2019-05-10T16:30:42Z No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)Approved for entry into archive by Raquel Dinelis ([email protected]) on 2019-08-01T19:27:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 samara_latge_ioc_dout_2018.pdf: 8436093 bytes, checksum: a20b0141540a48f012e3ea970210dec4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5)Made available in DSpace on 2019-08-01T19:27:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 samara_latge_ioc_dout_2018.pdf: 8436093 bytes, checksum: a20b0141540a48f012e3ea970210dec4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2018Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Lutzomyia longipalpis é o vetor de Leishmania infantum, um dos agentes causadores da leishmaniose visceral. Os flebotomíneos adultos possuem uma dieta rica em açúcares, essencial para atender às demandas energéticas necessárias ao desenvolvimento; as fêmeas, além de açúcares, também se alimentam de sangue. As α-glicosidases e α-amilases estão envolvidas na digestão de carboidratos adquiridos na dieta, e são classificadas nas famílias 13 e 31 das glicosídeo hidrolases. Para determinação da atividade de α-glicosidase utilizando o substrato MUαGlu padronizamos uma técnica de ensaio contínuo para realização de ensaios em amostras teciduais individuais. Quantificamos a atividade de α-glicosidase em diferentes tecidos, ressaltando a atividade presente no divertículo e no intestino médio de L. longipalpis, sendo essa enzima mais ativa sobre sacarose que sobre o substrato MUαGlu. Atividades basais foram observadas em insetos não alimentados; a alimentação sanguínea induz a atividade no conteúdo do intestino médio e a alimentação açucarada modula a atividade nos tecidos do intestino médio. A exposição a diferentes concentrações ou moléculas de açúcares também alterou a atividade. As α-glicosidases de diferentes tecidos apresentaram diferentes propriedades bioquímicas, como pH ótimo entre 7,0 - 8,0, KM entre 0,37 - 4,7 mM (MUαGlu como substrato), pH ótimo de 6,0 e KM entre 11 - 800 mM (sacarose como substrato) Enzimas do divertículo e do tecido do intestino médio apresentaram inibição em altas concentrações de substrato (sacarose), o que explica os altos valores de KM encontrados. No genoma de L. longipalpis foram encontradas nas famílias GH13 e GH31 proteínas envolvidas no metabolismo de açúcar, transporte de aminoácidos, armazenamento e mobilização das reservas de glicogênio e regulação da miogênese. Descrevemos também uma α-glicosidase neutra (controle de N-glicosilação) e uma α-glicosidase lisossomal inativa (sem resíduos catalícos). A estrutura e as funções dessas proteínas identificadas são conservadas. Uma análise comparativa demonstrou retração no número de genes de maltases e expansão das α-amilases, com organização em dois grandes clusters. Maltases são mais expressas no intestino médio de fêmeas alimentadas com sangue, e a infecção por L. mexicana modulou negativamente a sua expressão gênica. Em fêmeas alimentadas com sangue (sem sacarose), as taxas de infecção por L. mexicana e migração para a região da cárdia não foram afetadas, sugerindo que a migração não é inteiramente baseada nos estímulos de quimiotaxia pelas moléculas de açúcar. Contudo, a ausência de açúcar na dieta do inseto resultou no desenvolvimento de L. mexicana no intestino posterior. Todos esses resultados sugerem que as α-amilases evoluíram para assumir diferentes funções além da hidrólise de açúcares primários e que as α-glicosidases também estão envolvidas em diferentes processos metabólicos, como digestão de açúcares vegetais, digestão de glicoproteínas ou glicolipídios sanguíneos e mobilização de estoques energéticos.Lutzomyia longipalpis is the vector of the parasite Leishmania infantum, the causing agent of visceral leishmaniasis. Adult sand flies have a diet rich in sugars, essential to meet the energy demands for their development and females, besides of sugar, also feed on blood. α-glicosidases and α-amilases are involved in the digestion of dietary carbohydrates and are classified in families 13 and 31 of glycoside hydrolases. For determination of α-glucosidase activity using MUαGlu as substrate, we standardized a continuous assay technique for performing assays on individual tissue samples. α-glucosidase activity was quantified in different tissues. We described the activity present in the crop and midgut of L. longipalpis, being more active against sucrose than MUαGlu. Basal activities were observed in non-fed insects; blood feeding induced activity in the midgut contents, and sugar feeding modulated activity in the midgut tissues. Exposure to different sugar concentrations or moieties also changed α-glucosidase activity. α-glucosidases from different tissues showed different biochemical properties, with an optimum pH around 7.0 - 8.0, KM between 0.37 - 4.7 mM (MUαGlu as substrate), optimum pH around 6.0, and KM between 11 - 800 mM (sucrose as substrate). Enzymes from crop and midgut tissues showed inhibition in high substrate concentrations (sucrose), which explains the high KM values found In the L. longipalpis genome we identified proteins in the GH13 and GH31 families that are involved in sugar metabolism, amino acid transport, storage and mobilization of glycogen reserves, and myogenesis regulation. We also described a neutral α-glycosidase (control of N-glycosylation) and an inactive lysosomal α-glycosidase (no catalytic residues). Structure and functions of identified proteins are conserved. A comparative analysis showed a retraction in the number of maltases genes and expansion of α-amylases, with organization in two large clusters. This expansion is probably related to the specialization of these proteins to hydrolyze different substrates. α-amylases have different expression patterns depending on feeding condition and tissue analyzed. Maltases are higher expressed in midgut tissues of blood-fed females, and their gene expression was negatively modulated with L. mexicana infection. In blood-fed females (no sugar), the infections rates by L. mexicana and migration to cardia region were not affected, suggesting that migration is not entirely based on the chemotaxis stimuli by sugar molecules. However, sugar deprivation resulted in the development of L. mexicana in the sand fly hindgut. All these results suggest that α-amylases evolved to assume different functions other than hydrolysis of primary sugars and that α-glucosidases are also involved in different metabolic processes, like digestion of plant sugars, digestion of blood glycoproteins or glycolipids, and mobilization of energetic storages during starvation

Transmission blocking sugar baits for the control of Leishmania development inside sand flies using environmentally friendly beta-glycosides and their aglycones

Submitted by Sandra Infurna ([email protected]) on 2019-01-22T11:07:33Z No. of bitstreams: 1 taina_ferreira_etal_IOC_2018.pdf: 2753184 bytes, checksum: 0ca1961c8eb592f5d2c86f13873c692d (MD5)Approved for entry into archive by Sandra Infurna ([email protected]) on 2019-01-22T11:18:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 taina_ferreira_etal_IOC_2018.pdf: 2753184 bytes, checksum: 0ca1961c8eb592f5d2c86f13873c692d (MD5)Made available in DSpace on 2019-01-22T11:18:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 taina_ferreira_etal_IOC_2018.pdf: 2753184 bytes, checksum: 0ca1961c8eb592f5d2c86f13873c692d (MD5) Previous issue date: 2018Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Insetos. Rio de Janeiro, RJ. Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Endêmicas. Rio de Janeiro, RJ. Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Insetos. Rio de Janeiro, RJ. Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Doenças Parasitarias. Rio de Janeiro, RJ. Brasil / Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Entomologia Molecular. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Insetos. Rio de Janeiro, RJ. Brasil.University of Glasgow. Wellcome Centre for Molecular Parasitology. Glasgow, UK / El Colegio de la Frontera Sur. Unidad Villahermosa, Mexico.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Insetos. Rio de Janeiro, RJ. Brasil / Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Entomologia Molecular. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.The sand fly Lutzomyia longipalpis is the main vector of American visceral leishmaniasis, a disease caused by parasites of the genus Leishmania. Adults of this insect feed on blood (females only) or sugar from plant sources, but their digestion of carbohydrates is poorly studied. Beta-glycosides as esculin and amygdalin are plant compounds and release toxic compounds as esculetin and mandelonitrile when hydrolyzed. Beta-glucosidase and trehalase are essential enzymes in sand fly metabolism and participate in sugar digestion. It is therefore possible that the toxic portions of these glycosides, released during digestion, affect sand fly physiology and the development of Leishmania