Lysosomal biogenesis and function is critical for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans

Necrotic cell death is defined by distinctive morphological characteristics that are displayed by dying cells (Walker, N.I., B.V. Harmon, G.C. Gobe, and J.F. Kerr. 1988. Methods Achiev. Exp. Pathol. 13:18–54). The cellular events that transpire during necrosis to generate these necrotic traits are poorly understood. Recent studies in the nematode Caenorhabditis elegans show that cytoplasmic acidification develops during necrosis and is required for cell death (Syntichaki, P., C. Samara, and N. Tavernarakis. 2005. Curr. Biol. 15:1249–1254). However, the origin of cytoplasmic acidification remains elusive. We show that the alkalization of endosomal and lysosomal compartments ameliorates necrotic cell death triggered by diverse stimuli. In addition, mutations in genes that result in altered lysosomal biogenesis and function markedly affect neuronal necrosis. We used a genetically encoded fluorescent marker to follow lysosome fate during neurodegeneration in vivo. Strikingly, we found that lysosomes fuse and localize exclusively around a swollen nucleus. In the advanced stages of cell death, the nucleus condenses and migrates toward the periphery of the cell, whereas green fluorescent protein–labeled lysosomal membranes fade, indicating lysosomal rupture. Our findings demonstrate a prominent role for lysosomes in cellular destruction during necrotic cell death, which is likely conserved in metazoans

International organizations: their actions, the responsibility deriving from their wrongful acts and the prospects for the future

The law of international responsibility consists an important sector of international law which is directly related to the breach of an international obligation and the effort to eliminate the consequences of this breach. The aim of the present doctoral thesis, is tο study the cases of international responsibility of international organizations for internationally wrongful acts, as they are codified in the Draft Articles of the UN International Law Commission (ILC) and to bring forward their main aspects, by studying in depth and evaluating the arguments of the Commission, the states and international organizations. Methodologically, the thesis prioritizes the primary sources, with the ILC Draft Articles of 2011 on the international responsibility of international organizations and the ILC Draft Articles of 2001 on the international state responsibility to be the main sources of information, along with the reports of the ILC Special Rapporteurs and the General Assembly and Security Council resolutions. Initially, the thesis presents the evolution of the various organization forms of international society, from international conferences to international organizations, as well as the forms and characteristics of legal personality and its legal consequences. The concept of international responsibility is analyzed, as one of the legal consequences of legal personality, with the conditions of its substantiation. Then, the thesis enters the main object of its research, by studying the cases of international responsibility of international organizations, together with those of the international responsibility of a state in relation to the conduct of an international organization, as they are codified in the ILC Draft Articles. Some of their most important points stand out, such as the relations of attribution of conduct and attribution of responsibility between international organizations and their members, states and international organizations, as well as the study of the effective control concept and how it affects the final attribution of responsibility, along with the cases of multiple attribution of conduct. The thesis examines the points of convergence and divergence with the corresponding cases of international state responsibility and is found out, whether and to what extend is possible their transfer in the case of international organizations. Also, the thesis attempts to identify the legal characterization of the Draft Articles and the verification of the reasons for which they have not yet taken the form of an international treaty, while at the same time are evaluated the attitude and the decisions of the ILC and those of states and international organizations. Throughout the thesis the relevant case law of international and domestic courts is presented and commented. The Draft Articles, even in their present form, have their own legal value and dynamics, being able to influence the decisions of states, international organizations and courts, fact that is also linked to their prospect of being a respectful set of rules. The thesis concludes, that currently the Draft Articles are not totally able to prevent a would-be international offender from committing an internationally wrongful act, but without underestimating their contribution to the codification and progressive development of the international responsibility law.Το δίκαιο της διεθνούς ευθύνης αποτελεί έναν σημαντικό κλάδο του διεθνούς δικαίου που σχετίζεται άμεσα με την παραβίαση μίας διεθνούς υποχρέωσης και με την προσπάθεια εξάλειψης των συνεπειών αυτής της παραβίασης. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη των περιπτώσεων της διεθνούς ευθύνης των διεθνών οργανισμών για διεθνείς αδικοπραξίες, έτσι όπως αυτές κωδικοποιούνται στα Σχέδια Άρθρων της Επιτροπής Διεθνούς Δικαίου (ΕΔΔ) του Οργανισμού Ηνωμένων Εθνών, και η ανάδειξη των κυριότερων πτυχών τους, μέσα από τη σε βάθος μελέτη και αξιολόγηση των επιχειρημάτων της Επιτροπής, των κρατών και των διεθνών οργανισμών. Μεθοδολογικά δίνεται προτεραιότητα στις πρωτογενείς πηγές, με το Σχέδιο Άρθρων του 2011 για τη διεθνή ευθύνη των διεθνών οργανισμών και το Σχέδιο Άρθρων του 2001 για τη διεθνή κρατική ευθύνη, να αποτελούν τις κύριες πηγές άντλησης πληροφοριών, μαζί με τις αναφορές των Ειδικών Εισηγητών της ΕΔΔ και τα ψηφίσματα της Γενικής Συνέλευσης και του Συμβουλίου Ασφαλείας. Αρχικά, παρουσιάζεται η εξέλιξη των διαφόρων μορφών οργάνωσης της διεθνούς κοινωνίας, από τις διεθνείς συνδιασκέψεις μέχρι τους διεθνείς οργανισμούς, καθώς και οι μορφές και τα χαρακτηριστικά της νομικής προσωπικότητας με τις έννομες συνέπειές της. Στη συνέχεια, αναλύεται η έννοια της διεθνούς ευθύνης, ως μία εκ των έννομων συνεπειών της νομικής προσωπικότητας, καθώς και οι προϋποθέσεις στοιχειοθέτησής της. Έπειτα, η διατριβή εισέρχεται στο βασικό αντικείμενο της έρευνάς της με τη μελέτη των περιπτώσεων διεθνούς ευθύνης των διεθνών οργανισμών, αλλά και εκείνων της διεθνούς ευθύνης κράτους σε σχέση με τη συμπεριφορά διεθνούς οργανισμού, έτσι όπως αυτές κωδικοποιούνται μέσα από Σχέδια Άρθρων της ΕΔΔ. Αναδεικνύονται μερικά από τα σημαντικότερα σημεία τους, όπως οι σχέσεις απόδοσης συμπεριφοράς και απόδοσης ευθύνης μεταξύ των διεθνών οργανισμών και των μελών τους, κρατών και διεθνών οργανισμών, καθώς και το περιεχόμενο της έννοιας του αποτελεσματικού ελέγχου (effective control) και το πώς αυτή επηρεάζει τον τελικό καταλογισμό της ευθύνης, όπως και οι περιπτώσεις της πολλαπλής απόδοσης συμπεριφοράς. Επίσης, εξετάζονται τα σημεία σύγκλισης και απόκλισης με τις αντίστοιχες περιπτώσεις για τη διεθνή κρατική ευθύνη και διαπιστώνεται, εάν και σε ποιο βαθμό είναι εφικτή η μεταφορά τους στην περίπτωση των διεθνών οργανισμών. Ακόμη, επιχειρείται ο νομικός χαρακτηρισμός των Σχεδίων Άρθρων και η εξακρίβωση των λόγων για τους οποίους αυτά δεν έχουν λάβει ακόμη τη μορφή μίας διεθνούς συνθήκης, ενώ παράλληλα αξιολογούνται η στάση και οι αποφάσεις της ΕΔΔ, μαζί με εκείνες των κρατών και των διεθνών οργανισμών. Σε όλη την έκταση της διατριβής παρατίθενται και σχολιάζονται ανάλογα νομολογικά παραδείγματα διεθνών και εσωτερικών δικαστηρίων. Τα Σχεδία Άρθρων, ακόμα και στην παρούσα μορφή τους, έχουν τη δική τους νομική αξία και δυναμική, όντας σε θέση να επηρεάσουν τις αποφάσεις των κρατών, των διεθνών οργανισμών και των δικαστηρίων, γεγονός που συνδέεται και με την προοπτική τους να αποτελέσουν ένα σύνολο κανόνων που θα γίνεται σεβαστό. Η διατριβή καταλήγει, ότι προς το παρόν, τα Σχέδια Άρθρων δεν είναι απολύτως ικανά να αποτρέψουν έναν επίδοξο διεθνή παραβάτη από την τέλεση μίας διεθνούς αδικοπραξίας, χωρίς όμως να υποτιμάται η συμβολή τους στην κωδικοποίηση και την προοδευτική ανάπτυξη του δικαίου της διεθνούς ευθύνης

Investigation of the mechanisms of necrotic cell death in the nematode Caenorhabditis elegans

Necrotic cell death underlies extensive neuronal loss in acute degenerative episodes, such as ischemic stroke, and in devastating human pathologies, like neurodegenerative diseases (Martin, 2001; Syntichaki and Tavernarakis, 2002). In the nematode Caenorhabditis elegans, hyperactivation of specific ion channels or hypoxia evoke an analogous pattern of neuronal death (Driscoll and Chalfie, 1991; Scott et al., 2002). Investigations in both nematodes and mammals implicate specific calpains and aspartyl proteases in the execution of necrotic cell death (Syntichaki and Tavernarakis, 2002; Yoshida et al., 2002). Aspartyl proteases achieve full activity under acidic conditions (Goll et al., 2003; Ishidoh and Kominami, 2002). However, the factors that induce aberrant activation of these otherwise benign enzymes during necrosis have been largely unknown. In this thesis we show that the function of the vacuolar H+-ATPase, a pump that acidifies endosomal and lysosomal compartments, is essential for the execution of necrotic cell death in the nematode Caenorhabditis elegans. Indeed, impairment of the vacuolar H+- ATPase function or alkalization of normally acidic intracellular organelles by weak bases protected against necrosis. The use of pH-sensitive green fluorescent protein (GFP)- molecules revealed reduction of cytoplasmic pH in dying cells. Intracellular acidification required the vacuolar H+-ATPase function. Suppression of necrosis by aspartyl protease but not calpain deficiency was further enhanced by conditions that perturbed intracellular acidification. Thus, intracellular pH is an important modulator of necrosis in C. elegans. We propose that the vacuolar H+-ATPase activity is required to establish necrosis-promoting acidic intracellular conditions that augment the function of executioner aspartyl proteases in degenerating cells. However, the origin of cytoplasmic acidification remained obscure. Mutations in genes that affect lysosomal biogenesis and function had a significant impact on necrotic death levels. By using a genetically encoded fluorescent marker to monitor lysosomal fate during necrosis in vivo, we found that lysosomes fuse and localize around a swollen nucleus. However, in advanced stages of cell death GFP–labeled lysosomal membranes faded, indicating lysosomal rupture. In conjunction with the effect of endocytic oganelle alkalization on necrotic death, the sum of our data suggests that lysosomes have a prominent role in cellular destruction during necrosis and facilitate pH reduction by releasing their acidic content. Similar mechanisms may contribute to necrotic cell death that follows extreme acidosis—for example, during stroke—in humans. The lysosomal system participates via the autophagic process to the degradation of intracellular proteins and organelles. We checked the involvement of autophagy in necrosis and found that it is required for necrotic death in C. elegans. Impairment of autophagy by genetic inactivation of autophagy genes or by pharmacological treatment suppressed necrosis. Excessive autophagosome formation was induced early during neurodegeneration. At more pronounced stages autophagosomes accumulated in the nucleus periphery, where they exhibited partial or complete colocalization with lysosomes and mitochondria. Autophagy induction was preceded by calpain activation and synergized with lysosomal catabolic mechanisms to facilitate cell death. These findings demonstrate that autophagy contributes to cellular destruction during necrosis. Thus, interfering with the autophagic process may protect neurons against necrotic damage in humans.Ο νεκρωτικός κυτταρικός θάνατος ευθύνεται για την εκτεταμένη απώλεια κυττάρων υπό ακραίες συνθήκες και συντελείται συνήθως κατά τη διάρκεια έντονων εκφυλιστικών επεισοδίων, όπως τα εγκεφαλικά και οι ισχαιμίες, καθώς και σε νευροεκφυλιστικές παθολογικές καταστάσεις του ανθρώπου (Martin, 2001; Syntichaki and Tavernarakis, 2002). Ανάλογο πρότυπο κυτταρικού θανάτου είναι δυνατόν να επαχθεί στο νηματώδη Caenorhabditis elegans λόγω υπερενεργοποίησης ιοντικών καναλιών ή χαμηλής συγκέντρωσης οξυγόνου (Driscoll and Chalfie, 1991; Scott et al., 2002). Μελέτες τόσο σε νηματώδεις όσο και σε θηλαστικά έχουν δείξει ότι η νεκρωτική καταστροφή των κυττάρων πραγματοποιείται με τη συμμετοχή καλπαϊνών και πρωτεασών ασπαρτικού (Syntichaki and Tavernarakis, 2002; Yoshida et al., 2002). Η μέγιστη ενεργότητα των τελευταίων επιτυγχάνεται υπό όξινες συνθήκες (Goll et al., 2003; Ishidoh and Kominami, 2002). Ωστόσο, οι παράγοντες που προκαλούν μη φυσιολογική και υπερβολική ενεργοποίηση αυτών των ενζύμων κατά τη νέκρωση δεν είναι γνωστοί. Δεδομένα που παρουσιάζονται στην παρούσα διατριβή υποδεικνύουν ότι η λειτουργία των κυστιδιακών ΑΤΡασών πρωτονίων, που συμβάλλουν στην οξίνιση ενδοσωμικών και λυσοσωμικών διαμερισμάτων του κυττάρου, απαιτείται για τη νέκρωση στο νηματώδη C. elegans. Παρεμπόδιση της δραστηριότητάς τους κατέστειλε σημαντικά το νεκρωτικό θάνατο. Τα επίπεδα νέκρωσης μειώθηκαν επίσης μετά από επώαση ζώων σε διαλύματα ασθενών βάσεων, που προκαλούν αύξηση στο pH φυσιολογικά όξινων ενδοκυτταρικών οργανιδίων. Η παρακολούθηση των μεταβολών του pH, με τη χρήση μορφών της φθορίζουσας πρωτεΐνης GFP ευαίσθητων στις συνθήκες οξύτητας, αποκάλυψε ότι συμβαίνει οξίνιση του κυτταροπλάσματος σε εκφυλιζόμενα κύτταρα υπό την προϋπόθεση ότι εκφράζουν λειτουργικές κυστιδιακές ΑΤΡάσες. Η δυσλειτουργία αυτών ενίσχυσε επιπλέον την καταστολή της νέκρωσης σε νηματώδεις με δυσλειτουργικές πρωτεάσες ασπαρτικού. Δεν παρατηρήθηκε ωστόσο περαιτέρω αύξηση του κυτταρικού θανάτου σε ζώα με μειωμένη ενεργότητα καλπαϊνών. Συμπερασματικά, το ενδοκυτταρικό pH παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της νέκρωσης στο C. elegans. Προτείνεται ότι η δράση των κυστιδιακών ΑΤΡασών απαιτείται για τη δημιουργία όξινων συνθηκών που προωθούν το νεκρωτικό θάνατο, αυξάνοντας πιθανά την ενεργότητα εκτελεστικών πρωτεασών ασπαρτικού στα εκφυλιζόμενα κύτταρα

Μελέτη του ρόλου του pH στο νεκρωτικό θάνατο νευρώνων του νηματώδους Caenorhabditis elegans

Διατμηματικό, συνεργαζόμενα Τμήματα Βιολογίας και Ιατρικής. Numerous studies implicate necrotic cell death in many devastating human pathologies, such as stroke and neurodegenerative diseases. It has been shown that specific calpains and aspartyl proteases are involved in dismantling the cell during necrotic cell death inflicted by a variety of insults in C. elegans. However, the precise mechanism by which these enzymes become activated and subsequently wreck havoc, demolishing the cell, remains unknown. A genetic screen for either enhancers or suppressors of necrotic cell death, in sensitized genetic backgrounds, where neurodegeneration is attenuated by calpain or aspartyl protease deficiency, implicated genes encoding regulators of cytoplasmic and lysosomal pH. In particular, mutations in subunits of the vacuolar (V) H+ ATPase, a pump that acidifies intracellular organelles including lysosomes and regulates cellular pH at the expense of ATP, significantly attenuate necrotic cell death. We observed similar effects on necrosis by RNAi with several subunits of the V ATPase, and by treatment with agents known to inhibit this pump, such as ammonium chloride. To further elucidate the role of intracellular pH in necrosis, we monitored intracellular in specific degenerating neurons using pH-sensitive GFP variants (pHluorins). We found that neurodegeneration is followed by marked decrease in cellular pH, which is partly alleviated by mutations or treatments reducing the activity of V ATPase and ameliorating cell death. In a striking analogy, acidosis accompanies neurodegeneration following stroke in mammals. Our findings suggest necrotic cell death mechanisms are likely conserved and that intracellular and lysosomal pH is an important determinant of necrosis. Consistently, we observed that induced alkalization of endosomal compartments by weak bases, significantly suppresses necrotic cell death. We propose that intracellular acidic pH conditions, which develop during necrosis, activate or further enhance the activity of acidic aspartyl proteases and other lysosomal hydrolases, thus contributing to cell destruction.Πολυάριθμες μελέτες δείχνουν ότι ο νεκρωτικός κυτταρικός θάνατος εμπλέκεται σε διάφορες ασθένειες του ανθρώπου, όπως εγκεφαλικά και νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι συγκεκριμένες calpains και aspartyl proteases είναι απαραίτητες για την νέκρωση, που επάγεται από μια ποικιλία ερεθισμάτων στο C. elegans. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός, με τον οποίο ενεργοποιούνται αυτά τα ένζυμα, οδηγώντας στην καταστροφή του κυττάρου, παραμένει άγνωστος. Μεταλλαγές σε υπομονάδες των vacuolar (V) H+ ATPases, που είναι αντλίες υπεύθυνες για την οξίνιση ενδοκυτταρικών οργανιδίων -όπως τα λυσοσώματα- και τη ρύθμιση του κυτταρικού pH με κατανάλωση ΑΤΡ, προκαλούν σημαντική καταστολή του νεκρωτικού θανάτου. Παρόμοια αποτελέσματα προκύπτουν και μετά από μείωση της έκφρασης διαφόρων υπομονάδων των V ATPases μέσω της τεχνικής RNAi, καθώς και με τη χρήση παραγόντων που παρεμποδίζουν τη λειτουργία της αντλίας, όπως το χλωριούχο αμμώνιο. Προκειμένου να διαλευκανθεί περαιτέρω ο ρόλος του ενδοκυτταρικού pH στη νέκρωση, προσδιορίστηκε το κυτταροπλασματικό pH σε συγκεκριμλενους εκφυλιζόμενους νευρώνες, με τη χρήση μορίων GFP, που είναι ευαίσθητα στις μεταβολές του pH (pHluorins). Διαπιστώθηκε ότι ο νευροεκφυλισμός συνοδεύεται από σημαντική μείωση του κυτταρικού pH. Η μείωση αυτή φαίνεται να αναστρέφεται μερικώς από μεταλλαγές ή χειρισμούς, που παρεμποδίζουν την ενεργότητα των V ATPases. Επιπλέον, αύξηση του pH νδοσωμικών κυστιδίων, με τη χρησιμοποίηση διαλυμάτων ασθενών βάσεων, οδήγησε σε σημαντική καταστολή της νέκρωσης. Ανάλογα, οξίνιση έχει παρατηρηθεί και κατά το νευροεκφυλισμό που πραγματοποιείται σε εγκεφαλικά επεισόδια θηλαστικών. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ένα συντηρημένο μηχανισμό νεκρωτικού θανάτου και υποδεικνύουν ότι το pH παίζει σημαντικό ρόλο. Προτείνεται ότι το όξινο ενδοκυτταρικό περιβάλλον, που αναπτύσσεται κατά τη διάρκεια της νέκρωσης, ενεργοποιεί ή ενισχύει τη δραστηριότητα των πρωτεασών ασπαρτικού και άλλων λυσοσωμικών ή κυτταροπλασματικών υδρολυτικών ενζύμων, συμβάλλοντας έτσι στην καταστροφή του κυττάρου

High-throughput Microfluidics and Ultrafast Optics for in Vivo Compound/Genetic Discoveries

Therapeutic treatment of spinal cord injuries, brain trauma, stroke, and neurodegenerative diseases will greatly benefit from the discovery of compounds that enhance neuronal regeneration following injury. We previously demonstrated the use of femtosecond laser microsurgery to induce precise and reproducible neural injury in C. elegans, and have developed microfluidic on-chip technologies that allow automated and rapid manipulation, orientation, and non-invasive immobilization of animals for sub-cellular resolution two-photon imaging and femtosecond-laser nanosurgery. These technologies include microfluidic whole-animal sorters, as well as integrated chips containing multiple addressable incubation chambers for exposure of individual animals to compounds and sub-cellular time-lapse imaging of hundreds of animals on a single chip. Our technologies can be used for a variety of highly sophisticated in vivo high-throughput compound and genetic screens, and we performed the first in vivo screen in C. elegans for compounds enhancing neuronal regrowth following femtosecond microsurgery. The compounds identified interact with a wide variety of cellular targets, such as cytoskeletal components, vesicle trafficking, and protein kinases that enhance neuronal regeneration

On-chip whole-animal manipulation for high-throughput subcellular-resolution in-vivo drug/genetic screening

Techniques for rapid and automated small-animal manipulation and immobilization are necessary for high-throughput in vivo genetic/drug screens using cellular and sub-cellular features in multicellular organisms. We present a suite of technologies for complex high-throughput whole-animal genetic and drug screens. We demonstrate a high-speed microfluidic sorter that can isolate and immobilize 'Caenorhabditis elegans' in a well-defined geometry, an integrated chip containing individually addressable screening chambers for incubation and exposure of individual animals to biochemical compounds, and a device for delivery of compound libraries in standard multiwell plates to microfluidic devices. The immobilization stability obtained by these devices is comparable to that of chemical anesthesia and the immobilization process does not affect lifespan, progeny production, or other aspects of animal health. The high-stability enables the use of a variety of key optical techniques. We use this to demonstrate femtosecond-laser nanosurgery and three-dimensional multiphoton microscopy to study neural regeneration at sub-cellular resolution in vivo.National Institutes of Health.(U.S.) (Director’s New Innovator Award Program (1-DP2-OD002989–01) part of NIH Roadmap for Medical

On-chip sub-cellular resolution whole-animal manipulation for high-throughput in vivo screening

We present a suite of technologies that can be combined to perform complex high-throughput whole-animal genetic and drug screens. When used in various combinations, these devices facilitate a variety of high-throughput assays using whole animals

High-throughput on-chip in vivo neural regeneration studies usingfemtosecond laser nano-surgery and microfluidics

In recent years, the advantages of using small invertebrate animals as model systems for human disease have become increasingly apparent and have resulted in three Nobel Prizes in medicine or chemistry during the last six years for studies conducted on the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans). The availability of a wide array of species-specific genetic techniques, along with the transparency of the worm and its ability to grow in minute volumes make C. elegans an extremely powerful model organism. We present a suite of technologies for complex high-throughput whole-animal genetic and drug screens. We demonstrate a high-speed microfluidic sorter that can isolate and immobilize C. elegans in a well-defined geometry, an integrated chip containing individually addressable screening chambers for incubation and exposure of individual animals to biochemical compounds, and a device for delivery of compound libraries in standard multiwell plates to microfluidic devices. The immobilization stability obtained by these devices is comparable to that of chemical anesthesia and the immobilization process does not affect lifespan, progeny production, or other aspects of animal health. The high-stability enables the use of a variety of key optical techniques. We use this to demonstrate femtosecond-laser nanosurgery and three-dimensional multiphoton microscopy. Used alone or in various combinations these devices facilitate a variety of high-throughput assays using whole animals, including mutagenesis and RNAi and drug screens at subcellular resolution, as well as high-throughput high-precision manipulations such as femtosecond-laser nanosurgery for large-scale in vivo neural degeneration and regeneration studies

Microfluidic in vivo screen identifies compounds enhancing neuronal regeneration

Compound screening is a powerful tool to identify new therapeutic targets, drug leads, and elucidate the fundamental mechanisms of biological processes. We report here the results of the first in vivo small-molecule screens for compounds enhancing neuronal regeneration. These screens are enabled by the microfluidic devices we have developed for C. elegans. The devices enable rapid and repeatable animal immobilization which allows high-throughput and precise surgery. Following surgery, animals are exposed to the contents of a small-molecule library and assayed for neuronal regeneration. Using this screening method we have identified several compounds that enhance neural regeneration in vivo.NIH Director's New Innovator Award Program (1-DP2-OD002989-01