Variabilidade genética e expressão dos RNAs longos não codificadores HLA Complex Group (HCGs) nos pênfigos foliáceo e vulgar

Orientadora: Profa. Dra. Danielle Malheiros FerreiraCoorientadores: Profa. Dra. Angelica Beate Winter Boldt e Dr. Rodrigo Coutinho de AlmeidaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 20/03/2020Inclui referênciasResumo: O pênfigo é um grupo de doenças autoimunes de pele, caracterizado pelo auto-reconhecimento de antígenos desmossomais, como desmogleína-1 (DSG1, em pênfigo foliáceo - PF), e -3 (DSG3, em pênfigo vulgar - PV), levando à acantólise e bolhas epidermais. Diversos estudos já demostraram associações de variantes genéticas (alelos, haplótipos, ou polimorfismos de nucleotídeo único - SNPs) com a susceptibilidade ao PF e PV. Como para outras doenças autoimunes, as associações mais fortes são com alelos de antígenos leucocitários humanos (HLA) de classe II, além de outros genes do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Recentemente, variantes genéticas localizadas em RNAs longos não codificadores (lncRNAs) vem sendo associados com diferentes doenças autoimunes, incluindo o PF. Neste estudo pioneiro, foi investigada a associação entre SNPs de lncRNAs de uma família multigênica localizada na região do MHC, denominada HLA Complex Group (HCG), com a susceptibilidade ao PF e PV. Para tal, a distribuição de SNPs em 13 genes de lncRNAs HCG (genotipados em chips de microarranjo Illumina) foi analisada em PF endêmico (227 pacientes e 194 controles brasileiros) e PV (241 pacientes e 1188 controles alemães), por regressão logística multivariada. Nove SNPs foram significativamente associados ao PF (FDR p<0,05), dos quais 7 se localizam no gene de lncRNA TSBP1-AS1 (que abriga o gene HCG23); um em HCG27 e um em HCG21. Além disso, 55 SNPs foram associados com PV (FDR p<0,01), pertencendo aos genes TSBP1-AS1 (38 SNPs), HCG17 (6), HCG27 (5), HCG22 (3), HCG20 (2) e HCG26 (1). Para investigar se os genes mais associados também estão diferencialmente expressos no pênfigo, foram então quantificados os níveis transcricionais de TSBP1, TSBP1-AS1, HCG23 e HCG27 em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de pacientes e controles brasileiros. Foi verificado que a expressão de HCG27 está mais elevada em PBMC de pacientes com PF (p=0,035, log2 DE = 1,3), enquanto TSBP1-AS1 esteve menos expresso em PBMC de pacientes com PV (p=0,029, DE = -1,29), em relação a indivíduos controle. Em concordância com estes resultados, as mesmas diferenças de expressão de HCG27 (p=0,032, DE = 1,7) e TSBP1-AS1 (p=0,032, DE = -0,99) também foram encontradas em ensaios funcionais com queratinócitos (linhagem celular HaCaT), após estes serem estimulados com anticorpos IgG de pacientes (5 PV e 5 PF) e controles (5) de uma coorte alemã. Além disso, níveis de mRNA de TSBP1 também estiveram diminuídos em PBMCs de PF endêmico (p=0,042, DE = -2,14), apesar de não apresentarem diferença em queratinócitos representativos de PF esporádico. Em suma, foi demonstrado neste estudo que os lncRNAs HCGs estão associados com a susceptibilidade genética ao PF e PV, sendo HCG27 e TSBP1-AS1 diferencialmente expressos nas respectivas doenças, em diferentes amostras. Estes resultados indicam um papel dos lncRNAs HCGs na patogênese dos pênfigos, e encorajam a condução de mais estudos funcionais que visem elucidar o papel destes genes no mecanismo molecular que contribui com o desencadeamento da autoimunidade patológica.Abstract: Pemphigus is a group of autoimmune skin diseases characterized by the autorecognition of desmosomal antigens, such as desmoglein-1 (DSG1, for pemphigus foliaceus - PF) and -3 (DSG3, for pemphigus vulgaris - PV), leading to acantholysis and epithelial blisters. Several studies have shown associations of genetic variants (alleles, haplotypes, or individual single nucleotide polymorphisms - SNPs) with PF and PV susceptibility, especially alleles of class II human leukocyte antigen (HLA) genes and other major histocompatibility complex (MHC) genes. Recently, genetic variants located in long non-coding RNAs (lncRNAs) have also been associated with many autoimmune diseases, including PF. In this pioneer study, it was investigated the association of genetic variants in lncRNAs of a multigenic family located in MHC region, classified as HLA complex group (HCG), with the susceptibility to PF and PV. To this end, the distribution of SNPs located in 13 HCG lncRNA genes (genotyped by Illumina microarrays) was analyzed in endemic PF (227 patients and 194 controls from Brazil) and in PV (241 patients and 1188 controls from Germany), applying multivariate logistic regression. We found 9 SNPs associated with endemic PF (FDR p<0.05): 7 located in the TSBP1-AS1 lncRNA gene (which hosts HCG23); one in HCG27 and one in HCG21. Moreover, 55 SNPs were found associated with PV (FDR p<0.01), overlapping the genes TSBP1- AS1 (38 SNPs), HCG17 (6), HCG27 (5), HCG22 (3), HCG20 (2) and HCG26 (1). To investigate if the most associated genes are differentially expressed in pemphigus, the transcriptional levels of TSBP1, TSBP1-AS1, HCG23 and HCG27 were quantified in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of Brazilian patients and controls. The HCG27 was found upregulated in PBMC of endemic PF patients (p=0.035, log2 FC = 1.3), while TSBP1-AS1 was downregulated in PBMC of PV patients (p=0.029, FC = - 1.29), when compared to control subjects. Accordingly, the same differences were also found in functional assays with cultured immortalized keratinocytes (HaCaT cell line) stimulated with IgG antibodies of patients (5 PV and 5 PF) and controls (5) from Germany. Moreover, TSBP1 mRNA levels were decreased in PBMCs of endemic PF patients (p=0.042, FC = -2.14), although no differences were found for this gene in keratinocytes representing sporadic PF. Taken together, it was demonstrated that HCG lncRNAs are associated with the genetic susceptibility for PF and PV, being HCG27 and TSBP1-AS1 also differentially expressed in the respective diseases, in different samples. These results indicate a role of HCG lncRNAs in pemphigus pathogenesis, and encourage the conduction of further studies to elucidate the role of these genes in molecular mechanisms contributing to the development of pathological autoimmunity

Associação entre polimorfismo do gene CD59 na expressão e susceptibilidade ao pênfigo foliáceo endêmico

Orientadora : Profª. Drª. Angélica Beate Winter BoldtDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 31/03/2016Inclui referências : f. 65-69-88-99Resumo: O pênfigo foliáceo (PF) é uma doença autoimune endêmica em áreas rurais brasileiras e caracterizada por acantólise e autoanticorpos contra antígenos desmossomais (particularmente a Desmogleína 1), acompanhado da ativação do sistema complemento e formação de bolhas epidermais dolorosas, de acometimento localizado ou generalizado. A proteína CD59 é uma importante reguladora da cascata do complemento, inibindo a formação do complexo de ataque à membrana e protegendo as células da lise, além de mediar transduções de sinais e ativação de linfócitos T, sendo sua deficiência envolvida em diversas doenças autoimunes. CD59 possui diferentes transcritos por processamento alternativo, dos quais apenas dois são amplamente expressos nos tecidos, o que sugere a presença de sítios altamente regulatórios em suas regiões não codificantes, com provável influência nas isoformas. Contudo, não há nenhum estudo associando polimorfismos de regiões não codificantes de CD59 em doenças autoimunes, demonstrando que apesar de sua importância, ainda se trata de um gene pouco explorado. Neste estudo, foram investigados seis polimorfismos não codificantes de CD59 com um possível efeito no processamento alternativo e na expressão gênica: rs861256, rs831625, rs831629, rs704701, rs1047581 e rs704697. Estes SNPs foram haplotipados em 157 pacientes e 215 controles por PCR sequênciaespecífica, e a expressão gênica foi avaliada em 82 indivíduos saudáveis por PCR em tempo real. O alelo G de rs861256 foi associado com o aumento da expressão gênica (P=0,024) e a susceptibilidade ao PF em mulheres (OR=4,11, P=0.0001), que também foram mais propensas a desenvolver lesões do tipo generalizadas (OR=4,3, P=0,009) e apresentar maior dificuldade de atingir a remissão (OR=3,7, P=0,045). Também foram observadas associações genéticas para o alelo G de rs831625 (OR=3,1, P=0,007) e A de rs704697 (OR=3,4, P=0,006) em mulheres euro-brasileiras, e para o alelo C de rs704701 (OR=2,33, P=0,037) em afro-brasileiros de ambos os sexos. Estes alelos constituem o haplótipo GGCCAA, que também leva ao aumento da susceptibilidade ao PF (OR=4,9, P=0,045). Portadores dos haplótipos GG, CC e AA (em cis ou em trans) apresentam maior expressão de mRNA (P=0,037), especialmente as mulheres (P=0.029). Em conclusão, maiores níveis transcricionais de CD59, por consequência de uma expressão gênica mais elevada ou da ausência de degradação do mRNA, parecem estar relacionados com a susceptibilidade ao PF, especialmente em mulheres. Este envolvimento pode ser devido a alterações transcricionais, levando a um excesso de isoformas não ideais, ou ainda ao papel de CD59 na transdução de sinais de células T e liberação de citocinas. Estas hipóteses devem ser posteriormente investigadas em estudos funcionais e com maior número amostral.Abstract: Pemphigus foliaceus (PF) is an autoimmune disease, endemic in Brazilian rural areas and characterized by acantholysis and autoantibodies against desmosomal antigens (particularly desmoglein 1), accompanied by complement system (CS) activation and painful epidermal blisters, with generalized or localized affection. CD59 protein is an important regulator of the complement cascade, inhibiting formation of the membrane attack complex and protecting the cells from destruction, in addition to mediate signal transductions and activation of T lymphocytes, and its deficiency involved in several autoimmune diseases. CD59 has different transcripts by alternative splicing, of which only two are widely expressed in tissues, suggesting the presence of highly regulatory sites in their noncoding regions, with probable influence on isoforms. However, there is no study involving polymorphisms in CD59 noncoding regions in autoimmune diseases, demonstrating that despite its importance, it is still a relatively unexplored gene. In the present study, we investigated six CD59 noncoding polymorphisms with a possible effect in alternative splicing and gene expression: rs861256, rs831625, rs831629, rs704701, rs1047581 and rs704697. These SNPs were haplotyped in 157 patients and 215 controls by PCR-SSP, and gene expression was evaluated in 82 healthy subjects by real-time RT-PCR. The G allele of rs861256 was associated with increased gene expression (P=0.024) and PF susceptibility in women (OR=4.11, P=0.0001), which were also more prone to develop generalized lesions (OR=4.3, P=0.009) and to not experience disease remission (OR=3.7, P=0.045). Genetic associations were also observed for the G allele rs831625 (OR=3.1, P=0.007) and A of rs704697 (OR=3.4, P=0.006) in Euro-Brazilian women, and for C allele of rs704701 (OR=2.33, P=0.037) in Afro-Brazilians of both sexes. These alleles constitute GGCCAA haplotype, which also leads to increased PF susceptibility (OR=4.9, P=0.045). Carriers of haplotypes GG, CC and AA (in cis or trans) have higher mRNA expression (P=0.037), especially women (P=0.029). In conclusion, higher transcriptional levels of CD59, for consequence of a higher gene expression or absence of mRNA degradation, seem to be related with susceptibility to PF, especially in women. This involvement may be due to transcriptional changes, leading to an excess of non-ideal isoforms, or to the CD59 role in T cell signal transduction and in cytokines release. This hypothesis should be further investigated in functional studies and the association results, replicated in independent cohorts with increasing sample sizes

Variabilidade genética e expressão dos RNAs longos não codificadores HLA Complex Group (HCGs) nos pênfigos foliáceo e vulgar

Orientadora: Profa. Dra. Danielle Malheiros FerreiraCoorientadores: Profa. Dra. Angelica Beate Winter Boldt e Dr. Rodrigo Coutinho de AlmeidaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 20/03/2020Inclui referênciasResumo: O pênfigo é um grupo de doenças autoimunes de pele, caracterizado pelo auto-reconhecimento de antígenos desmossomais, como desmogleína-1 (DSG1, em pênfigo foliáceo - PF), e -3 (DSG3, em pênfigo vulgar - PV), levando à acantólise e bolhas epidermais. Diversos estudos já demostraram associações de variantes genéticas (alelos, haplótipos, ou polimorfismos de nucleotídeo único - SNPs) com a susceptibilidade ao PF e PV. Como para outras doenças autoimunes, as associações mais fortes são com alelos de antígenos leucocitários humanos (HLA) de classe II, além de outros genes do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Recentemente, variantes genéticas localizadas em RNAs longos não codificadores (lncRNAs) vem sendo associados com diferentes doenças autoimunes, incluindo o PF. Neste estudo pioneiro, foi investigada a associação entre SNPs de lncRNAs de uma família multigênica localizada na região do MHC, denominada HLA Complex Group (HCG), com a susceptibilidade ao PF e PV. Para tal, a distribuição de SNPs em 13 genes de lncRNAs HCG (genotipados em chips de microarranjo Illumina) foi analisada em PF endêmico (227 pacientes e 194 controles brasileiros) e PV (241 pacientes e 1188 controles alemães), por regressão logística multivariada. Nove SNPs foram significativamente associados ao PF (FDR p<0,05), dos quais 7 se localizam no gene de lncRNA TSBP1-AS1 (que abriga o gene HCG23); um em HCG27 e um em HCG21. Além disso, 55 SNPs foram associados com PV (FDR p<0,01), pertencendo aos genes TSBP1-AS1 (38 SNPs), HCG17 (6), HCG27 (5), HCG22 (3), HCG20 (2) e HCG26 (1). Para investigar se os genes mais associados também estão diferencialmente expressos no pênfigo, foram então quantificados os níveis transcricionais de TSBP1, TSBP1-AS1, HCG23 e HCG27 em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de pacientes e controles brasileiros. Foi verificado que a expressão de HCG27 está mais elevada em PBMC de pacientes com PF (p=0,035, log2 DE = 1,3), enquanto TSBP1-AS1 esteve menos expresso em PBMC de pacientes com PV (p=0,029, DE = -1,29), em relação a indivíduos controle. Em concordância com estes resultados, as mesmas diferenças de expressão de HCG27 (p=0,032, DE = 1,7) e TSBP1-AS1 (p=0,032, DE = -0,99) também foram encontradas em ensaios funcionais com queratinócitos (linhagem celular HaCaT), após estes serem estimulados com anticorpos IgG de pacientes (5 PV e 5 PF) e controles (5) de uma coorte alemã. Além disso, níveis de mRNA de TSBP1 também estiveram diminuídos em PBMCs de PF endêmico (p=0,042, DE = -2,14), apesar de não apresentarem diferença em queratinócitos representativos de PF esporádico. Em suma, foi demonstrado neste estudo que os lncRNAs HCGs estão associados com a susceptibilidade genética ao PF e PV, sendo HCG27 e TSBP1-AS1 diferencialmente expressos nas respectivas doenças, em diferentes amostras. Estes resultados indicam um papel dos lncRNAs HCGs na patogênese dos pênfigos, e encorajam a condução de mais estudos funcionais que visem elucidar o papel destes genes no mecanismo molecular que contribui com o desencadeamento da autoimunidade patológica.Abstract: Pemphigus is a group of autoimmune skin diseases characterized by the autorecognition of desmosomal antigens, such as desmoglein-1 (DSG1, for pemphigus foliaceus - PF) and -3 (DSG3, for pemphigus vulgaris - PV), leading to acantholysis and epithelial blisters. Several studies have shown associations of genetic variants (alleles, haplotypes, or individual single nucleotide polymorphisms - SNPs) with PF and PV susceptibility, especially alleles of class II human leukocyte antigen (HLA) genes and other major histocompatibility complex (MHC) genes. Recently, genetic variants located in long non-coding RNAs (lncRNAs) have also been associated with many autoimmune diseases, including PF. In this pioneer study, it was investigated the association of genetic variants in lncRNAs of a multigenic family located in MHC region, classified as HLA complex group (HCG), with the susceptibility to PF and PV. To this end, the distribution of SNPs located in 13 HCG lncRNA genes (genotyped by Illumina microarrays) was analyzed in endemic PF (227 patients and 194 controls from Brazil) and in PV (241 patients and 1188 controls from Germany), applying multivariate logistic regression. We found 9 SNPs associated with endemic PF (FDR p<0.05): 7 located in the TSBP1-AS1 lncRNA gene (which hosts HCG23); one in HCG27 and one in HCG21. Moreover, 55 SNPs were found associated with PV (FDR p<0.01), overlapping the genes TSBP1- AS1 (38 SNPs), HCG17 (6), HCG27 (5), HCG22 (3), HCG20 (2) and HCG26 (1). To investigate if the most associated genes are differentially expressed in pemphigus, the transcriptional levels of TSBP1, TSBP1-AS1, HCG23 and HCG27 were quantified in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of Brazilian patients and controls. The HCG27 was found upregulated in PBMC of endemic PF patients (p=0.035, log2 FC = 1.3), while TSBP1-AS1 was downregulated in PBMC of PV patients (p=0.029, FC = - 1.29), when compared to control subjects. Accordingly, the same differences were also found in functional assays with cultured immortalized keratinocytes (HaCaT cell line) stimulated with IgG antibodies of patients (5 PV and 5 PF) and controls (5) from Germany. Moreover, TSBP1 mRNA levels were decreased in PBMCs of endemic PF patients (p=0.042, FC = -2.14), although no differences were found for this gene in keratinocytes representing sporadic PF. Taken together, it was demonstrated that HCG lncRNAs are associated with the genetic susceptibility for PF and PV, being HCG27 and TSBP1-AS1 also differentially expressed in the respective diseases, in different samples. These results indicate a role of HCG lncRNAs in pemphigus pathogenesis, and encourage the conduction of further studies to elucidate the role of these genes in molecular mechanisms contributing to the development of pathological autoimmunity

Associação entre polimorfismo do gene CD59 na expressão e susceptibilidade ao pênfigo foliáceo endêmico

Orientadora : Profª. Drª. Angélica Beate Winter BoldtDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 31/03/2016Inclui referências : f. 65-69-88-99Resumo: O pênfigo foliáceo (PF) é uma doença autoimune endêmica em áreas rurais brasileiras e caracterizada por acantólise e autoanticorpos contra antígenos desmossomais (particularmente a Desmogleína 1), acompanhado da ativação do sistema complemento e formação de bolhas epidermais dolorosas, de acometimento localizado ou generalizado. A proteína CD59 é uma importante reguladora da cascata do complemento, inibindo a formação do complexo de ataque à membrana e protegendo as células da lise, além de mediar transduções de sinais e ativação de linfócitos T, sendo sua deficiência envolvida em diversas doenças autoimunes. CD59 possui diferentes transcritos por processamento alternativo, dos quais apenas dois são amplamente expressos nos tecidos, o que sugere a presença de sítios altamente regulatórios em suas regiões não codificantes, com provável influência nas isoformas. Contudo, não há nenhum estudo associando polimorfismos de regiões não codificantes de CD59 em doenças autoimunes, demonstrando que apesar de sua importância, ainda se trata de um gene pouco explorado. Neste estudo, foram investigados seis polimorfismos não codificantes de CD59 com um possível efeito no processamento alternativo e na expressão gênica: rs861256, rs831625, rs831629, rs704701, rs1047581 e rs704697. Estes SNPs foram haplotipados em 157 pacientes e 215 controles por PCR sequênciaespecífica, e a expressão gênica foi avaliada em 82 indivíduos saudáveis por PCR em tempo real. O alelo G de rs861256 foi associado com o aumento da expressão gênica (P=0,024) e a susceptibilidade ao PF em mulheres (OR=4,11, P=0.0001), que também foram mais propensas a desenvolver lesões do tipo generalizadas (OR=4,3, P=0,009) e apresentar maior dificuldade de atingir a remissão (OR=3,7, P=0,045). Também foram observadas associações genéticas para o alelo G de rs831625 (OR=3,1, P=0,007) e A de rs704697 (OR=3,4, P=0,006) em mulheres euro-brasileiras, e para o alelo C de rs704701 (OR=2,33, P=0,037) em afro-brasileiros de ambos os sexos. Estes alelos constituem o haplótipo GGCCAA, que também leva ao aumento da susceptibilidade ao PF (OR=4,9, P=0,045). Portadores dos haplótipos GG, CC e AA (em cis ou em trans) apresentam maior expressão de mRNA (P=0,037), especialmente as mulheres (P=0.029). Em conclusão, maiores níveis transcricionais de CD59, por consequência de uma expressão gênica mais elevada ou da ausência de degradação do mRNA, parecem estar relacionados com a susceptibilidade ao PF, especialmente em mulheres. Este envolvimento pode ser devido a alterações transcricionais, levando a um excesso de isoformas não ideais, ou ainda ao papel de CD59 na transdução de sinais de células T e liberação de citocinas. Estas hipóteses devem ser posteriormente investigadas em estudos funcionais e com maior número amostral.Abstract: Pemphigus foliaceus (PF) is an autoimmune disease, endemic in Brazilian rural areas and characterized by acantholysis and autoantibodies against desmosomal antigens (particularly desmoglein 1), accompanied by complement system (CS) activation and painful epidermal blisters, with generalized or localized affection. CD59 protein is an important regulator of the complement cascade, inhibiting formation of the membrane attack complex and protecting the cells from destruction, in addition to mediate signal transductions and activation of T lymphocytes, and its deficiency involved in several autoimmune diseases. CD59 has different transcripts by alternative splicing, of which only two are widely expressed in tissues, suggesting the presence of highly regulatory sites in their noncoding regions, with probable influence on isoforms. However, there is no study involving polymorphisms in CD59 noncoding regions in autoimmune diseases, demonstrating that despite its importance, it is still a relatively unexplored gene. In the present study, we investigated six CD59 noncoding polymorphisms with a possible effect in alternative splicing and gene expression: rs861256, rs831625, rs831629, rs704701, rs1047581 and rs704697. These SNPs were haplotyped in 157 patients and 215 controls by PCR-SSP, and gene expression was evaluated in 82 healthy subjects by real-time RT-PCR. The G allele of rs861256 was associated with increased gene expression (P=0.024) and PF susceptibility in women (OR=4.11, P=0.0001), which were also more prone to develop generalized lesions (OR=4.3, P=0.009) and to not experience disease remission (OR=3.7, P=0.045). Genetic associations were also observed for the G allele rs831625 (OR=3.1, P=0.007) and A of rs704697 (OR=3.4, P=0.006) in Euro-Brazilian women, and for C allele of rs704701 (OR=2.33, P=0.037) in Afro-Brazilians of both sexes. These alleles constitute GGCCAA haplotype, which also leads to increased PF susceptibility (OR=4.9, P=0.045). Carriers of haplotypes GG, CC and AA (in cis or trans) have higher mRNA expression (P=0.037), especially women (P=0.029). In conclusion, higher transcriptional levels of CD59, for consequence of a higher gene expression or absence of mRNA degradation, seem to be related with susceptibility to PF, especially in women. This involvement may be due to transcriptional changes, leading to an excess of non-ideal isoforms, or to the CD59 role in T cell signal transduction and in cytokines release. This hypothesis should be further investigated in functional studies and the association results, replicated in independent cohorts with increasing sample sizes

Besides Pathology: Long Non-Coding RNA in Cell and Tissue Homeostasis

A significant proportion of mammalian genomes corresponds to genes that transcribe long non-coding RNAs (lncRNAs). Throughout the last decade, the number of studies concerning the roles played by lncRNAs in different biological processes has increased considerably. This intense interest in lncRNAs has produced a major shift in our understanding of gene and genome regulation and structure. It became apparent that lncRNAs regulate gene expression through several mechanisms. These RNAs function as transcriptional or post-transcriptional regulators through binding to histone-modifying complexes, to DNA, to transcription factors and other DNA binding proteins, to RNA polymerase II, to mRNA, or through the modulation of microRNA or enzyme function. Often, the lncRNA transcription itself rather than the lncRNA product appears to be regulatory. In this review, we highlight studies identifying lncRNAs in the homeostasis of various cell and tissue types or demonstrating their effects in the expression of protein-coding or other non-coding RNA genes

Doping of casted silk fibroin membranes with extracellular vesicles for regenerative therapy: a proof of concept

Abstract Bioactive material concepts for targeted therapy have been an important research focus in regenerative medicine for years. The aim of this study was to investigate a proof-of-concept composite structure in the form of a membrane made of natural silk fibroin (SF) and extracellular vesicles (EVs) from gingival fibroblasts. EVs have multiple abilities to act on their target cell and can thus play crucial roles in both physiology and regeneration. This study used pH neutral, degradable SF-based membranes, which have excellent cell- and tissue-specific properties, as the carrier material. The characterization of the vesicles showed a size range between 120 and 180 nm and a high expression of the usual EV markers (e.g. CD9, CD63 and CD81), measured by nanoparticle tracking analysis (NTA) and single-EV flow analysis (IFCM). An initial integration of the EVs into the membrane was analyzed using scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM) and vesicles were successfully detected, even if they were not homogeneously distributed in the membrane. Using direct and indirect tests, the cytocompatibility of the membranes with and without EVs could be proven and showed significant differences compared to the toxic control (p  0.05)

CD59

Pemphigus foliaceus (PF) is an autoimmune disease, endemic in Brazilian rural areas, characterized by acantholysis and accompanied by complement activation, with generalized or localized distribution of painful epidermal blisters. CD59 is an essential complement regulator, inhibiting formation of the membrane attack complex, and mediating signal transduction and activation of T lymphocytes. CD59 has different transcripts by alternative splicing, of which only two are widely expressed, suggesting the presence of regulatory sites in their noncoding regions. To date, there is no association study with polymorphisms in CD59 noncoding regions and susceptibility to autoimmune diseases. In this study, we aimed to evaluate if CD59 polymorphisms have a possible regulatory effect on gene expression and susceptibility to PF. Six noncoding polymorphisms were haplotyped in 157 patients and 215 controls by sequence-specific PCR, and CD59 mRNA levels were measured in 82 subjects, by qPCR. The rs861256-allele-G (rs861256*G) was associated with increased mRNA expression (p = .0113) and PF susceptibility in women (OR = 4.11, p = .0001), which were also more prone to develop generalized lesions (OR = 4.3, p = .009) and to resist disease remission (OR = 3.69, p = .045). Associations were also observed for rs831625*G (OR = 3.1, p = .007) and rs704697*A (OR = 3.4, p = .006) in Euro-Brazilian women, and for rs704701*C (OR = 2.33, p = .037) in Afro-Brazilians. These alleles constitute the GGCCAA haplotype, which also increases PF susceptibility (OR = 4.9, p = .045) and marks higher mRNA expression (p = .0025). In conclusion, higher CD59 transcriptional levels may be related with PF susceptibility (especially in women), probably due to the effect of genetic polymorphism and to the CD59 role in T cell signal transduction

Long Non-Coding RNAs in Multifactorial Diseases: Another Layer of Complexity

Multifactorial diseases such as cancer, cardiovascular conditions and neurological, immunological and metabolic disorders are a group of diseases caused by the combination of genetic and environmental factors. High-throughput RNA sequencing (RNA-seq) technologies have revealed that less than 2% of the genome corresponds to protein-coding genes, although most of the human genome is transcribed. The other transcripts include a large variety of non-coding RNAs (ncRNAs), and the continuous generation of RNA-seq data shows that ncRNAs are strongly deregulated and may be important players in pathological processes. A specific class of ncRNAs, the long non-coding RNAs (lncRNAs), has been intensively studied in human diseases. For clinical purposes, lncRNAs may have advantages mainly because of their specificity and differential expression patterns, as well as their ideal qualities for diagnosis and therapeutics. Multifactorial diseases are the major cause of death worldwide and many aspects of their development are not fully understood. Recent data about lncRNAs has improved our knowledge and helped risk assessment and prognosis of these pathologies. This review summarizes the involvement of some lncRNAs in the most common multifactorial diseases, with a focus on those with published functional data