Analiza molecular-genetică a unor boli monogenice ale sistemului nervos în Republica Moldova

Implementarea metodelor contemporane de studiu molecular-genetic în practica medicală, depistarea activă a purtătorilor heterozigoţi în familiile cu anamneză agravată vor avea un rol important în profilaxia si diagnosticul antenatal si presimptomatic al maladiilor ereditar

Aspecte clinico-genetice ale neuropatiilor senzitivo-motorii ereditare în Republica Moldova

Present work has given possibility to create national register of patients with Charcot-Marie-Tooth (CMT). This investigation is important for in time determination of clinic diagnosis, also for molecular genetic diagnosis post- and prenatal in families affected with CMT 1A. Were investigated 106 patients which constituted 79 families from Moldavian Republic. Pedigree analysis within this group revealed in 56% of cases autosomal dominant model (type) of inheritance. Incidence of duplications NMSE 1A of patients from Moldavian Republic is 69%. Analysis of D17S921, D17S122 and D17S834 markers for reviewed patients revealed next frequency : 23.88% of duplications for locus D17S921, 32.83% for locus D17S122 and 24.62% for D17S834 locus. Also has been found that one person may have mutations in 2 loci

Results of family screening in patients with Wilson’s disease in Moldova

Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu”, Chişinău, Republica MoldovaIntroducere. Boala Wilson (BW) - o boală genetică autozomal recesivă, respectiv Asociațiile Internaționale recomandă de efectuat screening-ul familial, cu examinarea rudelor de gradul I ale probandului (frați, descendenți și părinți). Unele studii arată că rudele îndepărtate, la fel, trebuie luate în considerare. Scopul lucrării. De a analiza membrii familiei probandului în depistarea cazurilor asimptomatice și inițierea tratamentului specific. Material și metode. Au fost evaluate retrospectiv 11 familii, în perioada 2008 2021. Scorul Ferenci a fost folosit pentru a evalua diagnosticul. Testarea genetică a fost efectuată în toate cazurile prin metoda de secvențiere Sanger, examinând exonii cu frecvență mare și moderată a mutațiilor. Rezultate. În 8 familii, probandul-unul dintre copii, fiind testate rudele de gradul I (părinți, +/- frați). Din ele, 6 cazuri: ambii părinți-heterozigoți simpli (HS); în 2 cazuri: 1 părinte-HS, al doilea-nici o mutație detectată. 4/8 familii au ≥ 2 copii, dintre care au fost identificați 2 frați asimptomatici, 4 frați-HS, 2 frați-fără mutații. În celelalte 3 familii, probandul-părinte cu BW diagnosticată. În cazul 1: partenerul-statut necunoscut, 1 copil-HS, celălalt-fără mutații; vărul suferea de BW. În cazul 2: partenerul-HS, fiind identificați 2 copii asimptomatici. În cazul 3: partenerul-statut necunoscut, 1 copil-HS. Toți membrii asimptomatici au inițiat tratament specific. Cele mai frecvente mutații au fost p.H1069Q și p.G1341D. Concluzii. Testul genetic este foarte important în a diferenția purtătorii sănătoși de membrii asimptomatici, având în vedere că tratamentul este pentru toată viața. Diagnosticul și terapia precoce sunt asociate cu un prognostic favorabil pentru BW.Background. Wilson’s disease (WD) - an autosomal recessive genetic disease and the International Associations recommend that family screening be performed, with the examination of the proband’s first-degree relatives (siblings, offspring, and parents). Some studies indicate distant relatives to be considered. Objective of the study. The paper aimed to analyze the family members of the proband in detecting asymptomatic cases and initiating treatment. Material and methods. There were retrospectively evaluated 11 families, between 2008-2021. The Ferenci score was used to assess the diagnosis. The Sanger sequencing method, examining exons with a high and moderate frequency of mutations, performed genetic testing in all cases. Results. In 8 families, the proband-one of the children and all first-degree relatives (parents, +/- siblings) were tested. Of these in 6 cases: both parents-simple heterozygotes (SH); in 2 cases: 1 parent-SH, the second-no pathogenic mutation detected. 4/8 families have ≥2 children, of which 2 asymptomatic siblings, 4 siblings-SH, and 2 siblings-without variants. In the other 3 families, the proband-the parent with diagnosed WD. In case 1: partner-unknown status, 1 childSH, the other-without mutations; but the cousin had WD. In case 2: partner-SH and identify 2 asymptomatic children. In case 3: partner-unknown status, 1 child-SH. All asymptomatic members initiated treatment. The most frequent mutations detected were p.H1069Q and p.G1341D. Conclusions. Genetic testing is very important in differentiating healthy carriers from asymptomatic members, given that treatment is lifelong. Early diagnosis and therapy are associated with a favorable prognosis for WD

Analysis of SMN1, NAIP and GTF2H2 gene status in correlation with spinal muscular atrophy

Introduction. Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a genetic disorder caused by the loss of the survival motor neuron (SMN1) gene in over 95% of cases. Additionally, mutations in genes associated with the SMA chromosomal region can influence disease progression. Aim: To analyze the status of the NAIP and GTF2H2 genes in correlation with SMA. Material and methods. The study included 105 patients suspected for SMA of which 50 with confirmed with SMA and 55 without causative deletions, and 107 healthy, unrelated individuals. The molecular genetics methods used were mPCR, PCR-RFLP and MLPA. Results. From 105 patients, 50 were confirmed with SMA. In this group were identified in 8 patients (16%) with a homozygous deletion of exon 5 of the NAIP gene, 4 patients (8%) had a heterozygous status, and 2 (4%) had duplications. In the rest of the patients (55), in which deletions of SMN1 exon 7 were not identified, homozygous deletion of exon 5 of the NAIP gene was established in one patient (2%), 3 patients (5%) had duplications of exon 5 of the NAIP gene, and one patient had 5 copies of the NAIP gene. In the 107 healthy controls, one patient (1%) was identified with a deletion of exon 5 of the NAIP gene. None of the patients with combined deletions of SMN1 and NAIP had deletions in GTF2H2. Conclusions. The frequency of deletions in the NAIP gene was found to be higher in the SMA patient group compared to the control group. Thus, a significant relationship was identified, the P value being <0.00001. The significance threshold was set at p<0.05. The genetic patterning of genes associated with SMA is an important aspect in the study of molecular pathophysiology and assessment of disease prognosis, especially in the approach to gene therapies

Diagnosticul atrofiei musculare spinale prin metoda qPCR

Background. Spinal muscular atrophy (SMA) is a progressive neuromuscular disease inherited in an autosomal recessive way. The prevalence of SMA in the RM constitutes 8.43 ±0,15:100000 population. 95% of SMA is caused by deletion of exon 7 of SMN1. In carrier couples there is a 25% chance of offspring with SMA. Objective of the study. Diagnosis of SMA trough qPCR method (caused by deletion of exon 7 SMN1) in Human Molecular Genetics Lab. This will reduce the time of diagnosis and offer the possibility to identify the carriers of deletion. Material and Method. 60 DNAs representing 15 couples from control group and 10 families (mother, father and child affected or suspected) were diagnosed for determining the status of exon 7 SMN1 by qPCR method, melting curve (2 replicates for SMN1 exon 7, 1 replicate for the ALB exon 12). The DNA concentration was measured by spectrophotometry. EvaGreen was used as a DNA-binding dye. Results. Diagnosis of SMA is available through different methods. The molecular genetic diagnosis by PCR-RFLP is expensive and time consuming than qPCR method. For all DNA samples, amplification occurred for both exon 12 ALB and exon 7 SMN1. According to the melting curves, In families with history of SMA 9 DNAs with heterozygous status were identified and 7 DNA with exon deletion 12 have the status normal for exon 7 gene SMN1 and for 2 DNAs the reaction did not take place. For 22 persons from control group the exon7 SMN1 was determined to be present and for 8 persons was determined heterozygous status (5 women and 3 men). Among those who are heterozygous, 2 people form the same couple. Conclusion. Considering the presence of treatment the diagnosis as soon as possible is needed and QPCR is an effective method for this: prenatal for families in which the history of SMA is already present, for newborns (newborn screening) and even in the family planning process (carrier screening). Introducere. Amiotrofia spinală (AMS) este o boală neuromusculară progresivă, moștenită autosomalrecesiv. Prevalența SMA în RM constituie 8,43±0,15:100000 populație. 95% din AMS este cauzată de deleția exonului 7 a genei SMN1. În cuplurile purtătoare de mutație există o șansă de 25% de descendenți cu SMA. Scopul lucrării. Diagnosticul prin qPCR a AMS (cauzată de deleția exonului 7 SMN1) în Laboratorul de genetică moleculară umană. Metoda reduce timpul de diagnostic și oferă posibilitatea de a identifica purtătorii de mutație. Material și Metode. 60 de ADN-uri reprezentând 15 cupluri din grupul de control și 10 familii (mamă, tată și copil afectat sau suspectat) au fost diagnosticate pentru a determina starea exonului 7 SMN1 prin metoda qPCR, melting curve (2 teste per ADN pentru SMN1 exon 7, 1 test pentru ALB exon 12). Concentrația de ADN a fost stabilită prin spectrofotometrie. EvaGreen a fost utilizat ca DNA-binding dye. Rezultate. Diagnosticul SMA este disponibil prin diferite metode. Diagnosticul molecular genetic prin PCR-RFLP este costisitor și consumă mai mult timp decât metoda qPCR. Pentru toate probele de AND (în afară de 2) amplificarea a avut loc atât pentru exonul 12 ALB, cât și pentru exonul 7 SMN1. Conform melting curve, pentru 22 de persoane din grupul de control, a fost determinată prezența exonului 7 SMN1 și pentru 8 persoane a fost determinat statutul heterozigot (5 femei și 3 bărbați). Printre cei care sunt heterozigoți, 2 persoane formează același cuplu. În familiile cu istoric de SMA, 9 ADN-uri au fost identificate cu statut heterozigot și 7 ADN cu deleția exonului. 12 ADN au statutul normal. Concluzii. Odată cu apariția tratamentului pentru SMA, este necesar diagnosticul rapid, iar QPCR este o metodă eficientă: în perioada prenatală pentru familiile cu istoric de SMA, pentru nou-născuți (screening nou-născut) și chiar în procesul de planificare familială (screening al purtătorului)

The correlation between phenotypic manifestations, type of mutation and alelic variants of the genes of folate cycle in patients with Duchenne/Becker muscular distrophy

Centrul de sănătate a reproducerii şi genetică medicală Catedra de genetică moleculară USMF „N. Testemiţanu Universitatea Academiei de Ştiinţe a MoldoveiThe correlation between phenotypic manifestations, type of mutation and alelic variants of the genes of folate cycle in patients with Duchenne/Becker muscular distrophy The frequency of different alelic variants of MTHFR gene in patients with DMD/B was estimated during this investigation. The incidence of C677T allelic variant in patients with DMD/B was 21,4%. This mutation leads to reduction of activity of MTHFR by 35-60%, and, consequently, leads to a reduced level of methionine, which influences the myopathyc process. Analysis of MTRR polymorphism revealed the prevalence of A66G (92,9%), which leads to 4- times lower activity of this enzyme. Patients with in-frame deletions in dystrophin gene in combination with heterozygous status MTHFR, MTRR genes have severe clinical picture instead the mild one. Patients with mild clinical picture have the next genotype of folate cycle genes: 677-TT, 1298- CC. A fost estimată incidenţa diferitelor variante alelice ale genei MTHFR la pacienţii cu DMD/B. Incidenţa variantei alelice C677T la pacienţi cu DMD/B constituie 21,4%. Substituţia dată determină micşorarea cantităţii de metionină, ceea ce influenţează procesul miopatic. Analiza polimorfismului genei MTRR a arătat prevalarea variantei alelice A66G (92,9%), cea ce conduce la micşorarea activităţii acestei enzime de 4 ori. La bolnavii cu deleţii in-frame în gena distrofinei în combinaţie cu starea heterozigotă după genele MTHFR, MTRR în locul tabloului clinic uşor se observă tabloul clinic grav. La bolnavi cu clinica uşoară a fost depistat polimorfismul genelor ciclului folat - 677-TT, 1298-CC

Cuprul interschimbabil – un nou indicator de diagnostic pentru boala Wilson

Introduction. Estimating the „free” copper has been proposed as a diagnostic test for Wilson’s disease (WD) but was not approved by the international guidelines, due to a lack of data about the link between “free” copper and the different clinical presentations. New biomarkers are being investigated. Aim. The paper aims to analyze the bibliographic data on the new tools for diagnostic in WD, like exchangeable copper (CuEXC). Methods. An advanced search was performed in the PubMed, and ScienceDirect databases, using the search English terms: „Wilson’s disease”, „diagnostic test”, „exchangeable copper” and „relative exchangeable copper”. Results. CuEXC is a new validated method for the direct determination of labile copper. The relative exchangeable copper (REC) – the ratio of CuEXC/total serum copper - was compared to the usual tests used for WD diagnosis at different stages. Regardless of sex, age, or the degree of underlying liver failure, a REC value > 18.5% emerged as the best biomarker for the diagnosis of WD showing 100% sensitivity and 100% specificity, also confirmed in non-Wilsonian liver disease. Family screening in asymptomatic subjects observed that REC determination significantly differentiated subjects without WD from WD patients with a cutoff of 15%. Conclusions. Being a tool with high sensitivity and specificity, the determination of REC can be useful, reliable, rapid, and easy to set up to confirm or exclude WD in both adults and children, in carriers or asymptomatic patients.Introducere. Calcularea cuprului „liber” a fost propusă ca test de diagnostic pentru boala Wilson (BW), dar nu a fost aprobată de ghidurile internaționale, din cauza lipsei de date despre legătura dintre cuprul „liber” și prezentări clinice diferite ale bolii. Biomarkeri noi sunt investigați. Scopul lucrării. Scopul lucrării este de a analiza datele bibliografice privind metode noi de diagnostic în BW, precum cuprul interschimbabil (CuEXC). Material și Metode. A fost efectuată o căutare avansată în bazele de date PubMed și ScienceDirect, folosind termenii de căutare în limba engleză: „Wilson’s disease”, „diagnostic test”, „exchangeable copper” și „ relative exchangeable copper”. Rezultate. CuEXC este o metodă nouă validată pentru detectarea directă a cuprului labil. Cuprul interschimbabil relativ (REC) - raport CuEXC/ Cuprul seric total - a fost comparat cu testele standarde utilizate pentru diagnosticarea BW, la diferite stadii ale bolii. Indiferent de sex, vârstă sau gradul de insuficiență hepatică, o valoare REC > 18,5% se arată a fi cel mai bun biomarker pentru diagnosticul BW, cu o 100% sensibilitate și 100% specificitate, lucru confirmat și în leziunile hepatice non-Wilsoniane. Screening-ul familial la subiecții asimptomatici, a evidențiat că determinarea REC diferențiază semnificativ subiecții fără BW de pacienții cu BW cu un cut-off de 15%. Concluzii. Fiind un instrument cu o sensibilitate și specificitate înaltă, determinarea REC poate fi utilă, fiabilă, rapidă și ușor de efectuat pentru a confirma sau a exclude BW atât la adulți, cât și la copii, la purtători sau la pacienții asimptomatici

Молекулярно-генетическая диагностика в Pеспублике Mолдова: история и перспективы

IMSP Institutul Mamei şi Copilului, Universitatea de Stat de Medicină şi Farmacie ”Nicolae Testemiţanu”The first group of specialists in molecular genetics included two assistant researchers. It was created in the frame of the department for hereditary pathologies of the Scientific Research Institute of Mother and Child healthcare, under the leadership of the doctor Amoashii D., Ph.D., twenty-five years ago. A major influence on the training of the Moldavian young specialists played members of the Laboratory of Prenatal Diagnostic (led by Professor Baranov B.S., corresponding member of the RAMS) from Scientific Research Institute of obstetrics and gynecology D.O. Otto, Sankt-Petersburg, Russian Federation, head of the laboratory, professor Barbacari N. from the Institute of Genetics ASM. First molecular genetics tests in Moldova (since 1992) were realized to detect mutations and analyze populational aspects of the polymorphism of two genes determining monogenic pathologies – Duchenne myodystrophy (Sacara V.) and hemophilia A and B (Romanova L.), phenylketonuria (Gavriliuc А.) and cystic fibrosis (Gimbovskaya S.), spinal muscular atrophy (Sacara V.). In 1997, under the leadership of professor Groppa St., the national program ”Improvement of the medical genetic service in the Republic of Moldova. 1998-2005” was elaborated and later approved by the Ministry of Health, The program contained main strategies of regionalization and optimization of the medical genetic service structure, including the objective of the deepening of the molecular genetic investigations. As an entity in the frame of the National Center of Reproductive Health and Medical Genetics, the laboratory of Human Molecular Genetics appeared in 2009. From 2010, there started the development of candidate gene allelic variants detection methods. Hereditary predisposition to frequent chronic diseases is determined by various genes, target ones being: MTHFR, MTRR, MTR, CBS, FV, FII, FXIII, VKORCI, GpIIIaL33P, PAI-1, GSTM, GSTT, GSTP, ACE, eNOS, ApoB, ApoE, HLA DQA1, and DQB1. Genes with modification effects (MTHFR, MTRR, MTR, eNOS) were investigated for their role and association in the case of DMD/B that helped in the improvement of pathogenetic stages explanation of the abnormal processes, but also to develop a personalized approach in the treatment. Research investigations were supported through governmental grants, provided through ASM, and international grants provided by MRDA, BMBF, DAAD, and other funds. This support contributed to the skill development and experience gain in leading laboratories in Europe and the USA.Двадцать пять лет назад, в рамках научного отдела наследственных патологий НИИ Охраны Здоровья Матери и Ребёнка под руководством доктора медицинских наук Д. Амоаший создалась первая молекулярно-генетическая группа (2 младших научных сотрудника). Большой вклад в формирование молдавских специалистов оказали сотрудники Лаборатории Пренатальной Диагностики (заведующий лабораторией, член-корреспондент РАМН, профессор В.С. Баранов) Научно-исследовательского института акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта, г. Санкт-Петербурга, РФ, а, также заведующий лабораторией Института Генетики РМ профессор Барбакарь Н. Первые молекулярно-генетические анализы (1992 г.), проводимые в Молдове, были направлены на идентификацию мутаций и изучение популяционных особенностей полиморфизма генов при двух моногенных патологиях – миодистрофии Дюшенна (Сакарэ. В.) и гемофилии А и Б (Романова Л.), фенилкетонурии (Гаврилюк А.) и муковисцидоза (Гимбовская С.), спинальной мышечной атрофии (Сакарэ В.). В 1997 году под руководством проф. Ст. Гроппа была разработана и в дальнейшем одобрена Министерством Здравоохранения РМ национальная программа «Совершенствование медико-генетической помощи в РМ. 1998- 2005 гг.». В данной программе были представлены основные стратегии по регионализации и оптимизации структуры медико-генетической помощи, в том числе стояла задача углубления молекулярно-генетических исследований. В 2009 году была организована научная лаборатория Молекулярной Генетики Человека как самостоятельная единица в рамках Национального Центра Репродуктивного Здоровья и Медицинской Генетики. С 2010 года в лаборатории начаты разработки ДНК методов по определению аллельных вариантов генов-кандидатов, ответственных за наследственную предрасположенность человека к частым хроническим заболеваниям: MTHFR, MTRR, MTR, CBS, FV, FII, FXIII, VKORCI, GpIIIaL33P, PAI-1, GSTM, GSTT, GSTP, ACE, eNOS, ApoB, ApoE, HLA DQA1 и DQB1. Проведено исследование роли и ассоциаций генов модификаторов (MTHFR, MTRR, MTR, eNOS) при МДД/Б, что позволило дополнить патогенетические звенья данного патологического процесса и разработать тактику персонифицированного лечения. Научные исследования лаборатории поддержаны государственными контрактами АНМ и грантами международных фондов MRDA, BMBF, DAAD и др., что позволило сотрудникам проходить стажировки и работать в ведущих лабораториях Америки и Европы

Disfuncția subclinică a ventricolului stâng la copiii cu distrofie musculară Duchenne

Paediatrics Department, Nicolae Testemitanu SUMPh Institute of Mother and ChildBackground. The prognosis for DMD is strongly associated with cardiac dysfunction, mainly represented by dilated cardiomyopathy, which usually occurs in the second decade. However, clinical detection can be challenging because of the lack of classical heart failure symptoms due to wheelchair dependence. Objective of the study. to assess echocardiographic measurements for early identification and discovery of myocardial dysfunction in pediatric patients with DMD using Speckle tracking analyze Material and Methods. Ten patients with DMD, aged 3–15 years, diagnosed with DMD, were enrolled in the study. The patients have been follow up-ed by assessing biochemical and instrumental methods. Results. None of the patients had symptoms or a history of cardiac involvement. Baseline measurements: mean age was 8.6 ± 4.08, heart rate - 95 ± 13 /min, ejection fraction Teicholz 55.7 ± 6.12 %. Global longitudinal strain from the combined apical four-, three- and two-chamber views was significantly lower: − 14.9 ± 3.5%. LV areas showing reduction of strain were mostly belonged to the basal inferior segments (n = 5) in patients with DMD. Conclusion. Speckle-tracking echocardiographic imaging is rising as a noninvasive functional useful biomarker to recognize in DMD-cardiomyopathy detection, by assessing early cardiac dysfunction and consequently start medical therapy at an earlier stage of the disease.Introducere. Prognosticul pentru DMD este puternic asociat cu patologia cardiacă, reprezentată în principal de cardiomiopatie dilatată, detectarea subclinică fiind o provocare din cauza lipsei simptomelor clasice de insuficiență cardiacă, datorate dependenței de scaunul cu rotile. Scopul lucrării. Evaluarea măsurătorilor ecocardiografice, pentru identificarea timpurie și descoperirea disfuncției miocardice la copii și adolescenți cu DMD, utilizând ECOCG Speckle tracking. Material și metode. Zece pacienți cu DMD, în vârstă de 3-15 ani, diagnosticați cu DMD, au fost antrenaţi în studiu. Pacienții au fost monitorizați prin evaluarea metodelor biochimice și instrumentale. Rezultate. Nici unul dintre pacienți nu a prezentat simptome sau antecedente de afectare cardiacă. Măsurătorile inițiale au reprezentat: vârsta medie de 8,6±4,08 ani, FCC medie - 95±13/min, fracția de ejecție Teicholz 55,7±6,12%. Strainul longitudinal global din vizualizări apicale combinate cu patru, trei și două camere a fost semnificativ redusă: - 14,9±3,5%. Zonele VS, care prezintă reducerea GLS, au aparținut în principal segmentelor inferioare bazale (n = 5), la pacienții cu DMD. Concluzii. Ecocardiografia prin Strain Rate crește ca un biomarker funcțional neinvaziv, în detectarea cardiomiopatiilor în cadrul maladiei Duchenne, prin evaluarea disfuncției cardiace precoce și, prin urmare, începe terapia într-un stadiu mai precoce ale bolii

Analiza molecular-genetică a genei PAH la pacienţii cu PKU din Republica Moldova

Fenilcetonuria (PKU) este o patologie metabolică ereditară cu transmitere autozom recesivă cauzată de deficienţa enzimei fenilalanin hidroxilaza (PAH). În urma blocului enzimatic creşte cantitatea Phe şi a metaboliţilor ei care sunt extrem de toxici pentru sistemul nervos în dezvoltare, suscitând un retard mental sever. Analizând rezultatele screening-ului neonatal frecvenţa PKU în Republica Moldova poate fi considerată de 1 la 7325 de nou-născuţi, cu o rată medie de cuprindere de 75,2%. Scopul lucrării a fost de a aprecia frecvenţa mutaţiilor cercetatate în gena PAH la pacienţii cu PKU moldoveni şi de a monitoriza efi cienţa diagnosticului molecular-genetic a PKU în Republica Moldova. Pentru aceasta au fost supuse cercetării molecular-genetice 89 de mostre de ADN a pacienţilor cu PKU moldoveni. În urma cercetării moleculare s-a stabilit că cea mai frecventă mutaţie în gena PAH în populaţia moldovenească este R408W (50,0%) urmată de P281L (5,1%), R262Q (3,9%) R158Q, R252W, (a câte 2,8% fiecare), IVS12nt1 (2,3%). Spectrul mutaţional din gena PAH cercetat în Republica Moldova la momentul actual permite depistarea mutaţiilor cu rata de 69,7%, ceea ce accentuează necesitatea implementării noilor metodici pentru depistarea mutaţiilor noi, ceea ce ar eficientiza efectuarea diagnosticului prenatal în familiile cu risc prevenind naşterea copiilor cu PKU în Republica Moldova