Regulation of Cell Proliferation and Differentiation by PPARβ/δ

Peroxisome proliferator-activated receptor-β/δ (PPARβ/δ) is a ligand-activated transcription factor with essential functions in the regulation of lipid catabolism, glucose homeostasis, and inflammation, which makes it a potentially relevant drug target for the treatment of major human diseases. In addition, there is strong evidence that PPARβ/δ modulates oncogenic signaling pathways and tumor growth. Consistent with these observations, numerous reports have clearly documented a role for PPARβ/δ in cell cycle control, differentiation, and apoptosis. However, the precise role of PPARβ/δ in tumorigenesis and cell proliferation remains controversial. This review summarizes our current knowledge and proposes a model corroborating the discrepant data in this area of research

A Role for PPARβ/δ in Tumor Stroma and Tumorigenesis

Peroxisome proliferator-activated receptor-β/δ (PPARβ/δ) is a transcription factor that is activated by endogenous fatty acid ligands and by synthetic agonists. Its role in the regulation of skeletal muscle fatty acid catabolism, glucose homeostasis, and cellular differentiation has been established in multiple studies. On the contrary, a role for PPARβ/δ in tumorigenesis is less clear because there are contradictory reports in the literature. However, the majority of these studies have not examined the role of PPARβ/δ in the tumor stroma. Recent evidence suggests that stromal PPARβ/δ regulates tumor endothelial cell proliferation and promotes differentiation leading to the properly orchestrated events required for tumor blood vessel formation. This review briefly summarizes the significance of these studies that may provide clues to help explain the reported discrepancies in the literature regarding the role of PPARβ/δ in tumorigenesis

Reverse crosstalk of TGFβ and PPARβ/δ signaling identified by transcriptional profiling

Previous work has provided strong evidence for a role of peroxisome proliferator-activated receptor β/δ (PPARβ/δ) and transforming growth factor-β (TGFβ) in inflammation and tumor stroma function, raising the possibility that both signaling pathways are interconnected. We have addressed this hypothesis by microarray analyses of human diploid fibroblasts induced to myofibroblastic differentiation, which revealed a substantial, mostly reverse crosstalk of both pathways and identified distinct classes of genes. A major class encompasses classical PPAR target genes, including ANGPTL4, CPT1A, ADRP and PDK4. These genes are repressed by TGFβ, which is counteracted by PPARβ/δ activation. This is mediated, at least in part, by the TGFβ-induced recruitment of the corepressor SMRT to PPAR response elements, and its release by PPARβ/δ ligands, indicating that TGFβ and PPARβ/δ signals are integrated by chromatin-associated complexes. A second class represents TGFβ-induced genes that are downregulated by PPARβ/δ agonists, exemplified by CD274 and IL6, which is consistent with the anti-inflammatory properties of PPARβ/δ ligands. Finally, cooperative regulation by both ligands was observed for a minor group of genes, including several regulators of cell proliferation. These observations indicate that PPARβ/δ is able to influence the expression of distinct sets of both TGFβ-repressed and TGFβ-activated genes in both directions

Chromatin Binding of c-REL and p65 Is Not Limiting for Macrophage IL12B Transcription During Immediate Suppression by Ovarian Carcinoma Ascites

Tumors frequently exploit homeostatic mechanisms that suppress expression of IL-12, a central mediator of inflammatory and anti-tumor responses. The p40 subunit of the IL-12 heterodimer, encoded by IL12B, is limiting for these functions. Ovarian carcinoma patients frequently produce ascites which exerts immunosuppression by means of soluble factors. The NFκB pathway is necessary for transcription of IL12B, which is not expressed in macrophages freshly isolated from ascites. This raises the possibility that ascites prevents IL12B expression by perturbing NFκB binding to chromatin. Here, we show that ascites-mediated suppression of IL12B induction by LPS plus IFNγ in primary human macrophages is rapid, and that suppression can be reversible after ascites withdrawal. Nuclear translocation of the NFκB transcription factors c-REL and p65 was strongly reduced by ascites. Surprisingly, however, their binding to the IL12B locus and to CXCL10, a second NFκB target gene, was unaltered, and the induction of CXCL10 transcription was not suppressed by ascites. These findings indicate that, despite its reduced nuclear translocation, NFκB function is not generally impaired by ascites, suggesting that ascites-borne signals target additional pathways to suppress IL12B induction. Consistent with these data, IL-10, a clinically relevant constituent of ascites and negative regulator of NFκB translocation, only partially recapitulated IL12B suppression by ascites. Finally, restoration of a defective IL-12 response by appropriate culture conditions was observed only in macrophages from a subset of donors, which may have important implications for the understanding of patient-specific immune responses

Genomewide Analyses Define Different Modes of Transcriptional Regulation by Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-β/δ (PPARβ/δ)

Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are nuclear receptors with essential functions in lipid, glucose and energy homeostasis, cell differentiation, inflammation and metabolic disorders, and represent important drug targets. PPARs heterodimerize with retinoid X receptors (RXRs) and can form transcriptional activator or repressor complexes at specific DNA elements (PPREs). It is believed that the decision between repression and activation is generally governed by a ligand-mediated switch. We have performed genomewide analyses of agonist-treated and PPARβ/δ-depleted human myofibroblasts to test this hypothesis and to identify global principles of PPARβ/δ-mediated gene regulation. Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-Seq) of PPARβ/δ, H3K4me3 and RNA polymerase II enrichment sites combined with transcriptional profiling enabled the definition of 112 bona fide PPARβ/δ target genes showing either of three distinct types of transcriptional response: (I) ligand-independent repression by PPARβ/δ; (II) ligand-induced activation and/or derepression by PPARβ/δ; and (III) ligand-independent activation by PPARβ/δ. These data identify PPRE-mediated repression as a major mechanism of transcriptional regulation by PPARβ/δ, but, unexpectedly, also show that only a subset of repressed genes are activated by a ligand-mediated switch. Our results also suggest that the type of transcriptional response by a given target gene is connected to the structure of its associated PPRE(s) and the biological function of its encoded protein. These observations have important implications for understanding the regulatory PPAR network and PPARβ/δ ligand-based drugs

Regulation der Transkription durch PPARβ/δ in Zelltypen des Tumorstroma

Der Peroxisomen-Proliferator aktivierte Rezeptor β (PPARβ) ist ein Liganden-induzierter Transkriptionsfaktor. PPARβ spielt eine wichtige Rolle im Lipidmetabolismus und bei der Energiehomöostase, weiterhin übernimmt er eine regulatorische Funktion bei der Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose. Zudem zeigten Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe eine Funktion in der Tumorangiogenese. Demnach führt die genetische Inaktivierung des Rezeptors zu einem hyperplastischen Phänotyp der in den Tumor einwachsenden Endothelzellen (ECs). Die Folge ist ein Vaskularisierungsdefekt, der für die Inhibition des Wachstums von syngenen Lewis Lung Tumoren in der Maus verantwortlich ist. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die retrovirale Reexpression von PPARβ zu einer verstärkten Reifung und Differenzierung von Endothelzellen in einem in vivo Modellsystem (Matrigel) führt. Im gleichen Modell waren bereits potentielle Zielgene von PPARβ identifiziert worden, die im Rahmen dieser Arbeit in verschiedenen experimentellen Systemen in Zellkultur validiert und charakterisiert wurden (genetische Inaktivierung, Reexpression und RNAi-vermittelte Inhibition von Pparb). Dabei konnte neben den Genen der bekannten Angiogenese-Regulatoren Cd36 und Thbs2 auch das für den Zellzyklusinhibitor p57KIP2 codierende Cdkn1c Gen als positiv reguliertes PPARβ Zielgen nachgewiesen werden. Zudem konnte ein funktionaler Zusammenhang zwischen PPARβ und p57KIP2 bei der Regulation der Proliferation von Fibroblasten gezeigt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte der Einfluss von Liganden und Transportproteinen auf die transkriptionelle Aktivität des Rezeptors analysiert werden. In einer kürzlich erschienenen Publikation wurde all-trans Retinsäure (atRA) als PPARβ Ligand beschrieben und sollte, im Gegensatz zu seiner bekannten Funktion als Ligand für die Retinsäure-Rezeptoren, über eine Bindung an PPARβ die Zellproliferation stimulieren. Untersuchungen der vorliegenden Dissertation konnten eine transkriptionelle Aktivierung von PPARβ und seiner Zielgene durch atRA sowie einen Einfluss des Fettsäuretransporters FABP5 jedoch eindeutig widerlegen. Die Fragestellung des dritten Teils dieser Arbeit war die nach einer möglichen posttranslationalen Modifikation von PPARβ durch Ubiquitinierung oder SUMOylierung, wie sie teilweise auch schon für PPARα und PPARγ beschrieben wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte zwar keine SUMOylierung von PPARβ nachgewiesen werden, jedoch eine deutliche Modifikation durch Ubiquitin und Degradation über das 26S-Proteasomsystem. Ein stabilisierender Einfluss von Liganden auf die Halbwertszeit von PPARβ wurde spezifisch nach dessen Überexpression beobachtet und könnte somit unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen relevant sein

Komplexität der Transkriptionsregulation durch PPARβ/δ

Der „peroxisome proliferator activated receptor β/δ“ (PPARβ/δ) ist ein Liganden-induzierbarer Transkriptionsfaktor, der neben einer essentiellen Rolle im Lipidmetabolismus und der Energiehomöostase auch Funktionen bei der Regulation der Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose besitzt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnten anhand von Expressionsanalysen und ChIP-Sequenzierung drei Klassen von Zielgenen in humanen Myofibroblasten identifiziert werden. Gene der ersten Klasse werden durch PPARβ/δ reprimiert und durch Agonisten schnell und stark aktiviert. Die zweite Klasse von Genen zeigt keine Repression durch PPARβ/δ. Die Induktion erfolgt durch Agonisten deutlich schwächer und langsamer und die Expression wird stark durch Antagonisten reprimiert. Die dritte Klasse enthält Gene, deren Expression direkt mit dem PPARβ/δ-Niveau korreliert, wobei die Regulation liganden-unabhängig ist. Desweiteren erfolgt die Bindung von PPARβ/δ im Gegensatz zur Klasse I und II ohne nachweisbare „PPAR response elements“ (PPREs). Zusammenfassend erlauben diese Daten somit die Definition unterschiedlicher Klassen von PPARβ/δ-Zielgenen, die sich in den Mechanismen ihrer Regulation unterscheiden. PPARβ/δ spielt nicht nur eine Schlüsselrolle in der Regulation metabolischer Signalwege sondern moduliert zudem inflammatorische Prozesse und besitzt eine essentielle Funktion im Tumorstroma, was auf eine funktionelle Interaktion von PPARβ/δ und Zytokin-Signalwegen hinweist. Im zweiten Teil der Arbeit konnte mittels genomweiter Expressionsanalyse gezeigt werden, dass PPARβ/δ- und „transforming growth factor β“ (TGFβ)-Signalwege in humanen Myofibroblasten funktionell miteinander agieren. Eine Anzahl von Genen werden kooperativ durch TGFβ und PPARβ/δ aktiviert. Für das Modellgen „angiopoeitin-like 4“ (ANGPTL4) konnten zwei Enhancer Regionen identifiziert werden, die für die synergistische Aktivierung verantwortlich sind. Ein TGFβ-induzierbarer, stromaufwärts vom Transkriptionsstart (TS) gelegener Enhancer (ca. -8,5 kb relativ zum TS) wird durch einen Mechanismus reguliert, der SMAD3, ETS1, RUNX2 und AP-1 Transkriptionsfaktoren einbezieht, welche mit mehreren benachbarten Bindestellen interagieren. Ein zweiter Enhancer (PPAR-E), der aus drei nebeneinander liegenden PPREs besteht, befindet sich im Intron 3 des ANGPTL4-Gens (ca. +3,5 kb relativ zum TS). Der PPAR-E wird durch alle drei PPAR-Subtypen stark aktiviert, wobei ein neuartiges PPRE Motiv eine zentrale Rolle einnimmt. Obwohl der PPAR-E nicht durch TGFβ reguliert wird, interagiert diese Region mit SMAD3, ETS1, RUNX2 und AP-1 in vivo, was eine mögliche mechanistische Erklärung für den beobachteten Synergismus liefert

The role of PPARβ/δ in human macrophages

Macrophages represent the most diverse cell type in biology. They adapt selectively to many stimuli allowing for precise functionality in any environment without harming the organism. Consequently, they monitor their surroundings carefully and react to a plethora of signals. Fatty acids and their derivatives are important signaling mediators in this context, which besides other signals impinge on the lipid-regulated nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor (PPARβ/δ). Studies conducted in mice have shown that ablation of PPARβ/δ results in the inability of adipose and liver macrophages to adopt an alternative anti-inflammatory activation state, demonstrating a prominent role of PPARβ/δ in macrophage function with implications for immune regulation. To date, however, systematic studies focusing on PPARβ/δ's role in human macrophages have not been reported. The first part of this thesis addresses the role of PPARβ/δ in human macrophages including its transcriptional network affecting a multitude of cellular processes. A major part of this network involves cell type independent canonical regulation, which is characterized by the binding of PPARβ/δ with its obligatory dimerization partner retinoid X receptor (RXR) to specific sites in the regulatory region of established and previously unreported target genes, their induction by agonists and repression by inverse agonists. Additionally, a new set of non-canonical regulated target genes is described. These genes lack chromatin-bound PPARβ/δ complexes, are repressed by agonists (inverse regulation) and are macrophage-selective. Consistent with the prevailing opinion and the induction of an IL4-like morphological phenotype by agonists, this mode of regulation inhibits pro-inflammatory signaling. Surprisingly, anti-inflammatory genes, such as CD32B, IDO1 and CD274 (PD-L1) were also repressed. Consistent with these results, immune functions such as CD8+ T cell activation were stimulated by these ligands. In combination, these findings point to a unique macrophage activation state induced by PPARβ/δ agonists with context dependent functions in immune regulation. The second part describes the PPARβ/δ-regulated transcriptome for tumor-associated macrophages (TAMs) from human serous ovarian carcinoma ascites. Interestingly, most canonical PPARβ/δ target genes were found to be upregulated and refractory to synthetic agonists as compared to monocyte-derived macrophages. This was not due to a TAM specific increase in PPARβ/δ protein level or recruitment to target genes. However, the unaffected response of these genes to inverse agonists hinted at the presence of endogenous activating ligands. Lipidomic analysis of malignancy-associated ascites indeed revealed very high concentrations of dietary polyunsaturated fatty acids (PUFAs), mainly linoleic and arachidonic acid. These PUFAs induced lipid droplet formation in macrophages which provide a potential reservoir for PPARβ/δ agonists and may serve as the causal nexus for target gene deregulation. Among the deregulated genes, ANGPTL4 is associated with shorter relapse-free survival, illustrating the potential clinical implications of these finding

Transkriptionsregulation der Pyruvatdehydrogenase-Kinase 4 (PDK4), einem zentralen Schalter des Glukosestoffwechsels, durch Zelladhäsion und onkogene Signalwege beim humanen Ovarialkarzinom

Das Ovarialkarzinom ist die gynäkologische Krebserkrankung mit der höchsten Letalität, was vor allem durch die passive Metastasierung über den Peritonealraum bedingt ist. Dabei breiten sich Tumorzellen als Einzelzellen oder mehrzellige Sphäroide über die Peritonealflüssigkeit aus, um an anderer Stelle Metastasen auszubilden. Der damit einhergehende Adhärenzverlust dieser Zellen ist demnach von großer klinischer Relevanz und bedarf weiterer funktioneller Analysen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte mit PDK4 erstmals ein Gen in primären humanen Ovarialkarzinomzellen und in der Modellzelllinie SKOV-3 identifiziert werden, dessen Expression stark von Adhärenz und Adhärenzverlust beeinflusst wird. Die mit dem Adhärenzverlust einhergehende Induktion scheint mit dem glykolytischen Metabolismus dieser Zellen funktionell in Verbindung zu stehen, im Einklang mit der zentralen Rolle von PDKs als negative Regulatoren der Pyruvatdehydrogenase und somit der Energiegewinnung aus Glukose durch oxidative Phosphorylierung. Eine detaillierte Untersuchung der adhärenzvermittelten PDK4-Regulation zeigte, dass Interaktionen zwischen Komponenten der Extrazellulärmatrix und Integrinen dafür verantwortlich sind. Der weitere Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der detaillierten mechanistischen Aufklärung dieser transkriptionellen Kontrolle und die damit verbundene Identifizierung der verantwortlichen Signalwege anhand der Modellzelllinie SKOV-3. Hierzu wurde nach pharmakologischer Modulation bestimmter Signalwege oder einer RNAi-vermittelten Inhibition spezifischer Signalproteine die Phosphorylierung kritischer Signalkomponenten, Chromatinbindung und Regulation von PDK4 untersucht. Die hierbei erzielten Ergebnisse deuten auf eine Kooperation mehrerer Signalwege bei der Regulation des PDK4-Gens durch Adhärenzverlust hin. Hierzu zählen der SRC-PI3K-AKT-Signalweg, die GSK3-β-Catenin-Signalkaskade, der Estrogenrezeptor, der Transkriptionsfaktor C/EBPβ und Umstrukturierungen des Aktinzytoskeletts. Über die adhärenzvermittelte PDK4-Regulation hinaus liefern die Ergebnisse dieser Arbeit ein Bild zur Transkriptionsregulation des PDK4-Gens durch tumorbiologisch relevante Signale im humanen Ovarialkarzinom. So führen die Aktivierung des Adenylylcyclase-cAMP-PKA-Signalwegs, die Inhibition des SRC-PI3K-AKT-Signalwegs sowie Estrogen, Glukokortikoid und Zell-Zell-Kontakte zu einer Induktion der PDK4-Expression. Die komplexe Regulation von PDK4, insbesondere auch durch onkogene Signalwege, und die zentrale Funktion im Glukosemetabolismus unterstreichen die essentielle Rolle von PDK4 im Tumormetabolismus und weisen auf PDK4 als mögliches therapeutisches Ziel bei der Behandlung des Ovarialkarzinoms hin