Structure and function of the cis-regulatory region of shavenbaby gene in Drosophila melanogaster

Fil: Sabarís Di Lorenzo, Gonzalo Julián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Structure and function of the cis-regulatory region of shavenbaby gene in Drosophila melanogaster

Fil: Sabarís Di Lorenzo, Gonzalo Julián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Structure and function of the cis-regulatory of shavenbaby gene in Drosophila melanogaster

Los programas genéticos del desarrollo en organismos multicelulares son regulados por cambios en la expresión génica. Estos cambios determinan los procesos de diferenciación celular que suceden durante el desarrollo de los metazoos. Los genes que gobiernan estos programas en general poseen regiones regulatorias de la transcripción con una arquitectura genética compleja. Las mismas contienen codificada la información necesaria para establecer dónde, cuándo y cuánto se expresa el gen en cuestión. Este trabajo de tesis tiene como objetivo general entender de manera integral cómo funcionan las regiones regulatorias de la transcripción en metazoos.En este trabajo utilizamos a la mosca Drosophila melanogaster como modelo experimental. Nos centramos en el análisis de la arquitectura y función de la región regulatoria de la transcripción del gen shavenbaby (svb). svb es un gen modelo establecido para el estudio de la estructura y evolución de regiones regulatorias. Este gen se expresa en las células epidérmicas del embrión y es indispensable para la formación de pelos no sensoriales (llamados ?tricomas?) en la cutícula de la larva de primer estadio. El patrón de expresión embrionario de svb es generado por siete enhancers que están localizados en una región de 90 kilobases ubicada río arriba del sitio de inicio de la transcripción del gen. Con el objeto de comprender in toto la arquitectura genética de la región regulatoria de svb generamos moscas transgénicas con construcciones reporteras de su actividad transcripcional. Encontramos que svb se expresa en el estadio larval y pupal de Drosophila melanogaster además de la ya descripta expresión en el embrión. La expresión de svb en tejidos internos de larva que no forman tricomas sugiere que svb puede tener otra función, además de generar tricomas, a lo largo del desarrollo de Drosophila.Luego estudiamos el patrón de expresión de svb en los estadios de larva y pupa y los elementos regulatorios que generan dicho patrón. Encontramos que los siete enhancers embrionarios de svb generan también expresión en los tejidos de larva y pupa. Esto indica que los enhancers de svb funcionan de manera pleiotrópica, es decir, presentan actividad en distintos tejidos a lo largo del desarrollo. Otra característica relevante que se desprendió de este análisis es que todos los enhancers presentan un alto nivel de redundancia en los patrones de expresión que generan en la epidermis del estadio pupal. Evaluamos el rol de la redundancia de los enhancers en la epidermis pupal y verificamos que la ausencia de cuatro de los siete enhancers de svb, no modifica el patrón de tricomas en la pupa. Por lo tanto, la redundancia de los enhancers en la epidermis pupal contribuye a la robustez del fenotipo de tricomas en este estadio.Finalmente exploramos la existencia de nuevos elementos regulatorios de la transcripción a través de deleciones de secuencias de ADN, sin función asignada hasta el momento, dentro de la región regulatoria de svb. Encontramos que existen otros elementos funcionales, además de los enhancers ya descriptos, que modulan la expresión de svb tanto en el estadio larval como pupal de Drosophila melanogaster.En esta tesis analizamos la regulación transcripcional de un gen a lo largo de la ontogenia. Nuestros resultados ayudan a comprender cómo está codificada la información dentro de las regiones regulatorias de la transcripción en genes que son requeridos durante distintas instancias del desarrollo y diferentes contextos celulares.Developmental programs in multicellular organisms are regulated by switches in gene expression. These switches determine the cellular differentiation processes that occur in development. The master control genes that govern developmental programs often have complex cis-regulatory regions, that define where, when and how much a gene is expressed. The main aim of this thesis was to shed light -on how Cis-regulatory regions function in metazoans. We have worked with the fly Drosophila melanogaster, focusing in the architecture and function of the cis—regulatory region of the shavenbaby (svb) gene. svb is an established model for the study of the structure and evolution of cis—regulatory regions. This gene is expressed in the epidermal cells of the embryo where it is necessary for the formation of non—sensory hairs (called "trichomes") that decorate the cuticle 0f the first instar larva. The embryonic expression pattern of svb is generated by seven enhancers that are located in a region of 90 kilobases, upstream of the transcription start site of the gene. In order to understand the genetic architecture of the cis-regulatory region of svb in toto we generated transgenic flies with different reporter constructs. We found that 51/19 is expressed in the lawal and pupal stage of Drosophila melanogaster as well. The expression of svb in larva tissues that do not form trichomes suggests that svb might have another function (in addition to generating trichomes). We studied the expression pattern of svb in larva and pupa and searched for the regulatory elements that generate these expression patterns. We found that the seven embryonic enhancers of 51/19 also generate svb expression in larval and pupal tissues. This indicates that the enhancers of 51/19 work in a pleiotropic manner -i.e. they are active in different tissues throughout development. Another relevant feature that emerged from this analysis is that all seven enhancers drive redundant patterns in the epidermis of the pupa. We evaluated the role of this redundancy by deleting four of the seven enhancers in the native svb locus. We observed that the lack of four of the seven enhancers of 51/17 does not modify the trichome pattern in the pupa. Thus, redundancy in the pupal epidermis contributes to robustness of the trichome phenotype in this stage. Finally, we looked for uncharacterized regulatory elements within the cis— regulatory region of svb through DNA deletions. We found novel regulatory elements that modulate svb expression both in larva and pupa. In this thesis we have analyzed the transcriptional regulation of a gene throughout the ontogeny of D. melanogaster. Our results shed light on how regulatory information is encoded within genes that are deployed in multiple time-points of development.Fil: Sabarís Di Lorenzo, Gonzalo Julián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Ecología, Genética y Evolución de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Ecología, Genética y Evolución de Buenos Aires; Argentin

Actors with Multiple Roles: Pleiotropic Enhancers and the Paradigm of Enhancer Modularity

The current paradigm in the field of gene regulation postulates that regulatory information for generating gene expression is organized into modules (enhancers), each containing the information for driving gene expression in a single spatiotemporal context. This modular organization is thought to facilitate the evolution of gene expression by minimizing pleiotropic effects. Here we review recent studies that provide evidence of quite the opposite: (i) enhancers can function in multiple developmental contexts, implying that enhancers can be pleiotropic, (ii) transcription factor binding sites within pleiotropic enhancers are reused in different contexts, and (iii) pleiotropy impacts the structure and evolution of enhancers. Altogether, this evidence suggests that enhancer pleiotropy is pervasive in animal genomes, challenging the commonly held view of modularity.Fil: Sabarís Di Lorenzo, Gonzalo Julián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Laiker, Ian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Preger Ben Noon, Ella. The Ruth And Bruce Rappaport Faculty Of Medicine; IsraelFil: Frankel, Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin

Purification and characterization of a GH43 β-xylosidase from Enterobacter sp. identified and cloned from forest soil bacteria

The use of lignocellulosic biomass for second generation biofuels requires optimization of enzymatic breakdown of plant cell walls. In this work, cellulolytic bacteria were isolated from a native and two cultivated forest soil samples. Amplification of glycosyl hydrolases was attempted by using a low stringency-degenerate primer PCR strategy, using total soil DNA and bulk DNA pooled from positive colonies as template. A set of primers was designed based on Acidothermus cellulolyticus genome, by search of conserved domains of glycosyl hydrolases (GH) families of interest. Using this approach, a fragment containing an open reading frame (ORF) with 98% identity to a putative GH43 beta-xylosidase coding gene from Enterobacter cloacae was amplified and cloned. The full protein was expressed in Escherichia coli as N-terminal or C-terminal His-tagged fusions and purified under native conditions. Only N-terminal fusion protein, His-Xyl43, presented beta-xylosidase activity. On pNPX, optimal activity was achieved at pH 6 and 40°C and Km and Kcat values were 2.92mM and 1.32seg-1, respectively. Activity was also demonstrated on xylobiose (X2), with Km 17.8mM and Kcat 380s-1. These results demonstrated that Xyl43 is a functional beta-xylosidase and it is the first evidence of this activity for Enterobacter sp.Fil: Campos, Eleonora. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Negro Alvarez, María José. Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas; EspañaFil: Sabarís Di Lorenzo, Gonzalo Julián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: González, Sergio Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Rorig, Marcela. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación de Recursos Naturales. Instituto de Suelos; ArgentinaFil: Talia, Paola. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Grasso, Daniel Hector. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación de Recursos Naturales. Instituto de Suelos; ArgentinaFil: Sáez, Felicia. Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas; EspañaFil: Manzanares Secades, Paloma. Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas; EspañaFil: Ballesteros Perdices, Mercedes. Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas; EspañaFil: Cataldi, Ángel Adrián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentin