Analyse phosphoprotéomique pour la recherche de biomarqueurs (développements et applications)

L analyse protéomique est une méthode de choix pour la recherche de biomarqueurs. Sans à priori, elle permet d établir un catalogue de protéines qui sont exprimées dans une cellule, un tissu ou un organisme entier. Cette approche a été mise en œuvre pour une analyse protéomique de cellules coliques cancéreuses et une analyse phosphoprotéomique de biopsies hépatiques.L étude de cellules coliques cancéreuses transformées par le gène cytosine désaminase et traitées par la prodrogue 5-fluorocytosine a été réalisée par électrophorèse bidimensionnelle des extraits protéiques. L analyse d image a permis la quantification de 353 protéines et isoformes dont 14 sont surexprimées et 4 sous exprimées lors d un traitement par la prodrogue. Parmi les protéines dont l expression est affectée par le traitement, l HSP90 présente un niveau d expression constant mais est identifiée sous deux formes qui diffèrent par leur pI. L analyse par spectrométrie de masse à identifier une phosphorylation de ser 254 qui pourrait contribuer à la régression tumorale.Après avoir développé une méthode HPLC-TiO2 pour la purification de phosphopeptides, une analyse protéomique de 24 biopsies humaines provenant de carcinomes hépatocellulaires sur foie non fibreux (nf-CHC) et de tissus sains a été réalisée avec la technologie iTRAQ. Les peptides surexprimés dans les tumeurs correspondent à des protéines de choc thermiques, des protéines liées à l ADN/ARN (histones, protéines du splicéosome), des protéines de la phase 1 de la détoxification (carboxyestérase, époxide hydrolase), les protéines du cytosquelette (actinine, tubuline), des protéines ou enzymes anti-oxydantes (superoxide dismutase, thiorédoxine). Les peptides sous-exprimés correspondent à des protéines du cycle de l urée, de la détoxification (alcool déhydrogénase) du métabolisme des sucres, des lipides et des acides aminés. Dans la fraction TiO2, 19 phosphopeptides sont significativement surexprimés et 15 phosphopeptides sont significativement sous exprimés, mettant en en évidence une surreprésentation du motif (S/T)P- parmi les phosphopeptides surexprimés dans les tumeurs. Une activation des proline directed kinases ou une inhibition des phosphatases correspondantes est donc probablement un événement caractéristique des nf-CHC. Ces peptides/protéines dérégulées sont autant de biomarqueurs potentiels pour le carcinome hépatocellulaire.Proteomic is a method of choice for biomarker research, without a priori, it establishes a directory of proteins that are expressed in a cell, tissue or an entire organism. This approach has been implemented for proteomic analysis of colon cancer cells and phosphoproteomic analysis of liver biopsies.The study of colon cancer cells transformed by the cytosine deaminase and treated with the prodrug 5-fluorocytosine was performed by two-dimensional electrophoresis. Image analysis allowed the quantification of 353 proteins, 14 isoforms are overexpressed and 4 under expressed during treatment with the prodrug. Among the proteins whose expression is affected by the treatment, HSP90 has a constant level of expression, but is identified in two isoforms that differ in their pI. Mass spectrometry identified phosphorylation of ser 254 which could contribute to tumour regression.After developed an HPLC- TiO2 method for the purification of phosphopeptides, a proteomic analysis of 24 biopsies from human hepatocellular carcinoma on non-fibrous liver (nfCHC) and normal tissue was performed with the iTRAQ technology. Peptides overexpressed in tumours correspond to HSPs, DNA / RNA binding proteins (histones, spliceosome), proteins form Phase 1 detoxification (carboxyesterase, epoxide hydrolase), the cytoskeletal proteins (actinin, tubulin), antioxidant proteins or enzymes (superoxide dismutase, thioredoxin). The under-expressed peptides belong to proteins of the urea cycle, the detoxification (alcohol dehydrogenase) metabolism of sugars, lipids and amino acids. In the TiO2 fraction, 19 phosphopeptides are significantly overexpressed and 15 phosphopeptides were significantly under-expressed. This phosphoproteome has demonstrated an overrepresentation of the (S/T)P pattern among overexpressed phosphopeptides, indicating activation of proline-directed kinases in nfCHC or inhibition of the corresponding phosphatases. These deregulated peptides/proteins are as potential biomarkers for hepatocellular carcinoma.BORDEAUX1-Bib.electronique (335229901) / SudocSudocFranceF

Primary Structure Revision and Active Site Mapping of E. Coli Isoleucyl-tRNA Synthetase by Means of Maldi Mass Spectrometry

The correct amino acid sequence of E. coli isoleucyl-tRNA synthetase (IleRS) was established by means of peptide mapping by MALDI mass spectrometry, using a set of four endoproteases (trypsin, LysC, AspN and GluC). Thereafter, the active site of IleRS was mapped by affinity labeling with reactive analogs of the substrates. For the ATP binding site, the affinity labeling reagent was pyridoxal 5'-diphospho-5'-adenosine (ADP-PL), whereas periodate-oxidized tRNAIle, the 2',3'-dialdehyde derivative of tRNAIle was used to label the binding site for the 3'-end of tRNA on the synthetase. Incubation of either reagent with IleRS resulted in a rapid loss of both the tRNAIle aminoacylation and isoleucinedependent isotopic ATP-PPi exchange activities. The stoichiometries of IleRS labeling by ADP-PL or tRNAIleox corresponded to 1 mol of reagent incorporated per mol of enzyme. Altogether, the oxidized 3'-end of tRNAIle and the pyridoxal moiety of the ATP analog ADP-PL react with the lysyl residues 601 and 604 of the consensus sequence 601KMSKS605. Identification of the binding site for L-isoleucine or for non cognate amino acids on E. coli IleRS was achieved by qualitative comparative labeling of the synthetase with bromomethyl ketone derivatives of L-isoleucine (IBMK) or of the non-cognate amino acids valine (VBMK), phenylalanine (FBMK) and norleucine (NleBMK). Labeling of the enzyme with IBMK resulted in a complete loss of isoleucine-dependent isotopic [32P]PPi-ATP exchange activity. VBMK, NleBMK and FBMK were also capable of abolishing the activity of IleRS, FBMK being the less efficient in inactivating the synthetase. Analysis by MALDI mass spectrometry designated cysteines-462 and -718 as the target residues of the substrate analog IBMK on E. coli IleRS, whereas VBMK, NleBMK and FBMK labeled in common His-394, His-478 and Cys-718. In addition, VBMK and NleBMK, which are chemically similar to IBMK, were found covalently bound to Cys-462, and VBMK was specifically attached to His-332 (or His-337) of the synthetase. The amino acid residues labeled by the substrate analogs are mainly distributed between three regions in the primary structure of E. coli IleRS: these are segments [325-394], [451-479] and [591-604]. In the 3-D structures of IleRS from T. thermophilus and S. aureus, the [325-394] stretch is part of the editing domain, while fragments [451-479] and [591-604] representing the isoleucine binding domain and the dinucleotide (or Rossmann) fold domain, respectively, are located in the catalytic core. His-332 of E. coli IleRS, that is strictly conserved among all the available IleRS sequences is located in the editing active site of the synthetase. It is proposed that His-332 of E. coli IleRS participates directly in hydrolysis, or helps to deprotonate the hydroxyl group of threonine at the hydrolytic site

The yeast ISN1 (YOR155c) gene encodes a new type of IMP-specific 5'-nucleotidase

BACKGROUND: The purine salvage enzyme inosine 5'-monophosphate (IMP)-specific 5'-nucleotidase catalyzes degradation of IMP to inosine. Although this enzymatic activity has been purified and characterized in Saccharomyces cerevisiae, the gene encoding IMP 5'-nucleotidase had not been identified. RESULTS: Mass spectrometry analysis of several peptides of this enzyme purified from yeast allowed identification of the corresponding gene as YOR155c, an open reading frame of unknown function, renamed ISN1. The deduced Isn1p sequence was clearly not homologous to 5'-nucleotidases from other species. However, significant similarities to Isn1p were found in proteins of unknown function from Neurospora crassa, Plasmodium falciparum and several yeast species. Knock-out of ISN1 resulted in the total loss of IMP-specific 5'-nucleotidase activity, thus confirming that the ISN1 gene indeed encodes the enzymatic activity purified from yeast. In vivo studies revealed that, when IMP is overproduced through constitutive activation of the IMP de novo synthesis pathway, ISN1 is required for excretion of inosine and hypoxanthine in the medium. CONCLUSION: We have identified a new yeast gene, ISN1 (YOR155c), as encoding IMP-specific 5'-nucleotidase activity. The ISN1 gene defines a new type of 5'-nucleotidase which was demonstrated to be functional in vivo

Etude de modifications covalentes de protéines par spectrométrie de masse Maldi-Tof et Esi-Tof

PALAISEAU-Polytechnique (914772301) / SudocSudocFranceF

L' échange isotopique hydrogène/deutérium et la spéctrométrie de masse pour l'étude d'interactions protéine-protéine

BORDEAUX1-BU Sciences-Talence (335222101) / SudocSudocFranceF

Une approche moléculaire de l'astringence des vins (utilisation de sondes pour l'étude des interactions entre protéines de la salive et polyphénols)

L astringence est une sensation de sécheresse ressentie en bouche lors de la dégustation des vins rouges, qui résulte de la complexation entre les polyphénols du vin et les protéines de la salive, provoquant une diminution de lubrification en bouche. Parmi les protéines salivaires, les protéines riches en prolines (PRP) sont connues pour leur capacité à se lier aux polyphénols et à précipiter avec eux. Une meilleure connaissance de ce phénomène au niveau moléculaire est nécessaire pour le comprendre et le maîtriser. Il a été montré qu un peptide de quatorze acides aminés, IB714, dont la séquence est conservée au sein des protéines riches en proline, était un mime représentatif des PRP. Un travail préliminaire par spectrométrie de masse résolue en énergie a permis de caractériser les interactions entre des polyphénols et le peptide IB714. Une échelle d affinité en phase gazeuse a ainsi été déterminée. Cependant, cette méthodologie d analyse d un système modèle ne permet pas de s accommoder de la complexité du vin. C est pourquoi nous avons conçu une nouvelle stratégie reposant sur l'utilisation de sondes moléculaires immobilisée sur des billes magnétiques. Dans un premier temps nous avons élaboré une sonde peptidique, en greffant le peptide IB714 sur des billes magnétiques portant des fonctions carboxylates. Cette sonde peptidique a ensuite été étudiée avec des polyphénols modèles. Après sédimentation des billes magnétiques, les polyphénols non captés par la sonde ont été dosés par spectrométrie de masse en utilisant un étalon interne. Une échelle d'affinité en phase liquide a été établie de cette manière. Les positions relatives des polyphénols modèles sur cette échelle sont similaires à celles qui ont été établies en phase gazeuse. Dans un second temps, nous avons construit sur le même principe une sonde polyphénolique. Pour cela, un polyphénol modifié chimiquement a été immobilisé sur des billes magnétiques portant des fonctions amines. Cette sonde polyphénolique a été utilisée pour étudier l'interaction avec le peptide IB714. Par ailleurs, pour préparer une étude des interactions entre polyphénols et protéines salivaires avec des mélanges plus complexes que les systèmes modèles, une étude de fractionnement des protéines salivaires a été entreprise, permettant notamment de d éliminer l amylase, protéine majoritaire de la salive humaine. De même, un fractionnement d un vin rouge a été entrepris pour disposer de fractions de tannins caractérisées par spectrométrie de masse. La sonde peptidique est l outil moléculaire qui offre le plus de perspectives de développement ultérieur.Astringency is a pucker or dry mouth sensation, typically experimented with red wine tasting, that finds its origin in the complexation of polyphenols with salivary proteins, producing a reduced lubrication of the oral cavity. Among salivary proteins, proline rich proteins (PRPs) are well known for their capacity to bind and precipitate dietary polyphenols. A better knowledge of this phenomenon at the molecular level is required in order to master it. A 14 amino acid stretch from the PRP IB7 has been synthesized and shown to be a representative mimic of PRPs. Previous work by Energy Resolved Mass Spectrometry (ERMS) allowed characterizing the keys parameters of the interactions between these polyphenols and the IB714 probe. An affinity scale in the gas phase was determined in this way. However, the ERMS approach was hardly compatible with the complexity of wine polyphenols, and a validation of the affinity scale in condensed phase was required. Thus, we designed a new strategy relying on the use of molecular probes immobilized on magnetic beads. A peptidic probe was obtained by grafting the synthetic IB714 peptide on magnetic beads bearing carboxylate functions, and used to study its interaction with model polyphenols. After magnetic precipitation of the beads, unbound polyphenols left in the supernatant were quantified by mass spectrometry using an internal standard. An affinity scale in liquid phase was established in this way. Relative positions of model polyphenols on this latter scale were similar to those determined by ERMS. A polyphenolic probe was obtained by grafting a model polyphenol on beads bearing amine functions. This probe has been used to study the interaction with IB714. To prepare further work on more complex mixtures, attempts were made to fractionate human saliva; this allowed eliminating amylase, the major salivary protein. Wine tannins were also fractionated, in order to isolate condensed polyphenols that are characterized by mass spectrometry. The peptidic probe is the molecular tool that offers the best perspectives for future work.BORDEAUX1-Bib.electronique (335229901) / SudocSudocFranceF

La spectrométrie de masse dans l'étude de l'interaction entre protéines de la salive humaine et polyphénols (vers une approche analytique de l'astringence du vin)

L'astringence est une qualité organoleptique particulièrement importante dans l'évaluation de la qualité du vin rouge. Cette sensation est issue de la précipitation de protéines salivaires par les polyphénols. Pour accéder aux caractéristiques moléculaires qui gouvernent cette interaction, des systèmes modèles ont été constitués à l'aide de flavonoïdes variés et de fragments de proteines riches en prolines. A cette in, deux peptides de 14 et 34 acides aminés ont été synthétisés sur support solide. L'allongement de la séquence du peptide modèle sert à valider la pertinence du modèle face à la proteine entière. La méthodologie mise en place fait appel à la spectrométrie de masse résolue en énergie, en utilisant une ionisation en mode d'électronébulisation. Après l'obtention des complexes non-covalents en phase gazeuse, nous avons isolé puis dissocié ces édifices supramoléculaires de manière contrôlée. Les courbes de ruptures obtenues ont donné ainsi accès à une valeur caractéristique de l'interaction peptide/flvonoïde (ED50). Cette valeur de comparaison a permis d'établir une échelle d'affinité relative en phase gazeuse. Dans un premier temps, la validité intrinsèque de la méthode a été confortée, notamment par la connaissance de l'influence du paramétrage du spectromètre de masse sur l'énergie interne des ions. Ensuite, la pertinence de l'échelle pour appréhender la sensation d'astringence a été validée. Enfin, des relations structure-affinité ont été établies pour mettre en évidence, entre autres, les positions des groupements hydroxyles qui favorisent l'interaction. Cette méthodologie donne accès, à la fois, à une meilleure connaissance de l'interaction et à une évalutation ex-vivo de l'astringence.BORDEAUX1-BU Sciences-Talence (335222101) / SudocSudocFranceF

Identification et caractérisation par spectrométrie de masse de substances à activités biologiques produites par des souches de BacillusS

Les substances synthétisées par les bactéries du genre Bacillus présentent un grand intérêt en raison de leurs nombreuses activités antimicrobiennes. L objectif de ce travail a consisté à mettre au point un protocole analytique fiable pour extraire ces substances, et les caractériser par spectrométrie de masse et par leurs activités biologiques. Une première approche par spectrométrie de masse MALDI-ToF ne nous a pas donné de résultats satisfaisants en raison d un phénomène de suppression spectrale. Une seconde stratégie d étude combinant deux techniques analytiques a alors été envisagée. Les composés et les familles lipopeptidiques ont d abord été séparés par chromatographie liquide analytique et analysés en ligne en mode de couplage ESI-IT. Ensuite les fractions collectées ont été caractérisées par spectrométrie de masse MALDI-Q-ToF (et ESI-Q-ToF) pour déterminer les masses exactes et obtenir des spectres de fragmentation complémentaires des premiers. Ce procédé nous a permis d établir des critères d identification des composés et des familles de lipopeptides de structures connues. Cette caractérisation est basée sur des temps de rétention en chromatographie, des mesures de masses exactes et sur des schémas de fragmentations. Nous avons fait de même avec les composés non identifiés et ensuite évalué leur activité biologique en réalisant des tests de diffusion sur agar. Cette stratégie d étude permet de faire un criblage de l ensemble des biomolécules produites par des souches de Bacillus et de relier une structure à une activité biologique. Ce protocole, mis au point pour des cultures réalisées en milieu liquide, a ensuite été adapté aux cultures sur boîtes de Pétri pour pouvoir analyser les composés produits à l échelle de la colonie bactérienne.Compounds produced by Bacillus bacteria present a major interest because of their biological activities. The aim of this work was to develop a reliable analytical methodology to extract these compounds, and to characterize them by mass spectrometry and by their biological activities. A first approach by MALDI-ToF mass spectrometry doesn t give satisfactory results because of strong spectral suppression effects. Therefore, we have designed a second strategy which combined two analytical technologies. First, compounds and lipopeptides families were separated by analytical liquid chromatography and analysed by ESI-IT. Then, collected fractions were characterized by MALDI-Q-ToF (and ESI-Q-ToF) in order to determine accurate mass measurements and obtain complementary product ion spectra. This process led us to establish identification criteria of compounds and lipopeptides families which have known structures. This characterization is based of retention times in chromatography, accrurate mass measurements and fragmentation schemes. We have achieved the same experiments with non identified compounds and then assessed their biological activity by agar well diffusion test.This strategy allows to obtain a screening of whole of the biomolecules produced by bacillus strains and establishes a link between structure and biological activity. This methodology, designed for cultures in liquid medium, was then adapted to cultures in Petri disches in order to analyse compounds producted at the bacterial colony scale.BORDEAUX1-Bib.electronique (335229901) / SudocSudocFranceF

Caractérisation d'entités moléculaires de surface impliquées dans la relation de la bactérie probiotique Lactobacillus plantarum 299v avec l'hôte (approche in vitro)

Les microorganismes probiotiques mis en œuvre dans les aliments fonctionnalisés, sont capables de produire des effets bénéfiques sur la santé du consommateur. Ces effets dépendent entre autres de la capacité d adhésion des probiotiques aux constituants de l épithélium intestinal. L adhésion, est un phénomène complexe dépendant des propriétés physico-chimiques de la surface bactérienne ainsi que de la présence d entités protéiques et/ou non protéiques possédant une affinité pour les constituants de la muqueuse intestinale de l hôte. Au travers de l étude de l hydrophobie/hydrophilie et de la charge électrique de la surface de la souche probiotique Lactobacillus plantarum 299v ainsi que de celles d autres souches adhérentes de L. plantarum, une absence de corrélation entre de telles propriétés et la capacité d adhésion des souches sur les cibles mucine et cellules épithéliales intestinales Caco-2 a été établie. La caractérisation systématique des protéines associées à la paroi de L. plantarum 299v suivie de l estimation de leur affinité pour des cibles de la surface intestinale, ont conduit à l identification de la glyceraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) en tant qu adhésine potentielle. L analyse, par cytométrie en flux, des cellules de L. plantarum 299 v marquées par des anticorps anti-GAPDH et par l iodure de propidium a permis d établir un lien entre la perte d intégrité de la membrane plasmique et la présence de cette anchorless protein associée à la paroi bactérienne. Cette observation conduit à la proposition d un mécanisme original concernant l exportation de l enzyme cytoplasmique à la surface de la bactérie. D autres polymères non protéiques de type acides lipoteichoïques associés à la paroi, ont été caractérisés et leur implication dans l interaction de L. plantarum 299v avec la mucine et les cellules épithéliales intestinales Caco-2 a été démontrée.The probiotic microorganisms implemented in functionalized foods can produce beneficial effects on consumer health. These effects depend on the adhesion ability of probiotics to the constituents of the intestinal tract. The phenomenon of bacterial adhesion is a complex process which is mediated by the physico-chemical properties of the bacterial surface and by a set of proteinaceous and non-proteinaceous molecular entities with specific binding abilities to constituents of the host intestinal mucosa. Through the study of the hydrophobic/hydrophilic character and electric charge of the probiotic strain Lactobacillus plantarum 299v and those of other adherent strains of L. plantarum, no correlation between such properties and their adhesion ability to mucin and Caco-2 epithelial cells was established. The systematic characterization of the cell wall associated proteins of L. plantarum 299v followed by the estimation of their affinities for targets of the intestinal surface, led to the identification of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as a potential adhesin. Flow cytometry analysis of L. plantarum 299v cells labelled with anti-GAPDH and propidium iodide unambiguously confirmed a relationship between the loss of the plasma membrane integrity and location on cell wall of GAPDH and probably of other "anchorless protein". This observation led to us the proposal of an original mechanism on the export of this cytoplasmic enzyme to the bacterial cell wall surface. Other non-proteinaceous polymers like lipoteichoic acids have been characterized and their involvement in the interaction of L. plantarum 299v to mucin and Caco-2 monolayer cells was demonstrated.LIMOGES-BU Sciences (870852109) / SudocSudocFranceF

La spectrométrie de masse appliquée à la quantification des protéines médicaments dans le plasma

Le nombre croissant de médicaments protéiques utilisés en thérapeutique a créé des besoins dans le domaine de leur quantification, principalement dans le plasma, un milieu de composition protéique complexe. Le dosage, essentiel aux études pharmacocinétique/pharmacodynamique, ainsi qu à l optimisation de ces traitements, est compliqué par la nature protéique de ces médicaments et par les faibles concentrations auxquelles ils sont attendus dans ces milieux complexes. La méthodologie proposée se démarque des méthodes de dosage usuelles par son caractère universel. Elle fait appel à la spectrométrie de masse adaptée à la quantification des protéines grâce à l utilisation d un marquage isotopique différentiel des peptides : après enrichissement et protéolyse, l échantillon à doser est marqué sur les lysines par la version légère d un réactif de dérivation. En parallèle, les peptides de la protéine médicament pure marqués par la version lourde du réactif, servent d étalon interne. La possibilité de quantifier la protéine à partir de plusieurs de ses peptides améliore la fiabilité du dosage. Appliquée à l epoetin beta aux concentrations attendues en thérapeutique (autour de 0,5 femtomole/ L de plasma), la stratégie proposée permet de situer la limite de quantification à environ 50 attomoles d epoetin beta/ L de plasma avec une méthodologie de spectrométrie de masse nano-LC-ESI-Q-TRAP fonctionnant en mode MRM. Pour étendre l universalité de cette approche au champ des protéines médicaments pégylées, une seconde molécule a été étudiée. Il s agit de l interféron alfa-2b pégylé qui a permis de mettre en place une stratégie d extraction spécifique du médicament utilisant sa pégylation.The growing number of therapeutic proteins has created needs in the field of their quantification, mainly in plasma, which is a complex protein environment. Quantitative analysis of these proteins is essential for pharmacokinetics/pharmacodynamics studies, and for the optimization of treatments. However, the nature itself of the analyte and the low concentrations that are expected in plasma complicate the quantitative analysis. The proposed methodology differs from usual methods on its universal applicability. It relies on mass spectrometry adapted to the quantification of proteins by using peptides differential isotope labelling : after enrichment and proteolysis, the therapeutic protein and the plasmatic proteins are labelled on lysine residues by the light reagent. In parallel, peptides of the pure therapeutic protein, labelled by heavy version of reagent, are used as internal standard. The ability to quantify the protein with several of its peptides improves the reliability of the analysis. When applied to epoetin beta at expected therapeutic concentrations (about 0.5 femtomole/ L of plasma), the proposed strategy leads to a quantification limit close to 50 attomoles of epoetin beta/ L plasma, with a nano-LC-ESI-Q-TRAP mass spectrometry methodology operating in MRM. To extend the universal character of this approach to the field of pegylated protein drugs, a second therapeutic protein model has been studied. This model is a pegylated interferon alfa-2b which allowed developing a strategy for specific extraction of the drug relying on its pegylation.BORDEAUX1-Bib.electronique (335229901) / SudocSudocFranceF