A novel strategy for the comprehensive analysis of the biomolecular composition of isolated plasma membranes

A methodology for rapid, high-purity isolation of plasma membranes using superparamagnetic nanoparticles is described. The method is illustrated with high-resolution proteomic, glycomic and lipidomic analyses of presenilin-deficient cells

Fatty acid synthesis in cancer cells: a modulator of membrane functioning, cellular sensing and tissue morphogenesis

Kanker is wereldwijd één van de belangrijkste doodsoorzaken. Om meer vat te krijgen op deze ziekte en om meer doeltreffende vormen van kankertherapie te ontwikkelen, is het noodzakelijk om de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor kankerontwikkeling te ontrafelen en om de verschillen tussen kankercellen en normale cellen te onderzoeken. Een fundamenteel verschil dat al in de jaren 50 geobserveerd werd maar dat nog maar recent als een belangrijk kenmerk van agressieve kankers erkend wordt, is een verhoogde de novo synthese van vetzuren in kankercellen. Activatie van deze metabole pathway is betrokken bij de productie van membranen voor snelle proliferatie. In deze thesis hebben we onderzocht of deze activatie een meer diepgaande rol speelt. In het eerste deel van dit doctoraatsproject hebben we de meest directe effecten van lipogenese onderzocht: de daaruit voortvloeiende veranderingen in de lipidensamenstelling van kankercellen en de gevolgen van deze wijzigingen voor kankercelbiologie. Fosfolipidenanalyses met behulp van massaspectrometrie hebben aangetoond dat klinische tumorweefsels met een lipogeen fenotype een hogere graad van lipidenverzadiging vertonen dan niet-lipogene tumoren. Blokkering van de lipogene activiteit in kankercellen door behandeling met de lipogenese-inhibitor soraphen A of door het uitschakelen van lipogene enzymen met siRNA resulteerde in een opmerkelijke daling in verzadigde en mono-onverzadigde fosfolipide-soorten en verhoogde de relatieve graad van poly-onverzadiging. Aangezien poly-onverzadigde vetzuurketens veel gevoeliger zijn voor peroxidatie, werd de vorming van peroxidatie-eindproducten bevorderd door inhibitie van de lipogenese. Het maakte de cellen ook gevoeliger voor oxidatieve stress-geïnduceerde celdood. Vermits verzadigde lipiden een compactere structuur vormen, veranderde modulatie van lipogenese ook de laterale en transversale membraanmobiliteit. Dit werd aangetoond door de diffusie van membraan-verankerd GFP en door de opname van en reactie op doxorubicine. Deze gegevens bewijzen dat de novo lipogenese in kankercellen een enorme verandering teweegbrengt in membraaneigenschappen en de cellen beschermt tegen endogene en exogene aanvallen door de verzadiging van membraanlipiden te verhogen. Ze verschaffen ook een argument voor het gebruik van lipogenese-inhibitoren als sensibilisator voor chemotherapeutica.In het tweede deel van deze thesis hebben we het lipogene fenotype van kankercellen nagebootst in het Xenopus laevis model door injectie van SREBP1c om de invloed op weefselontwikkeling te onderzoeken. We observeerden dramatische morfologische veranderingen en konden deze koppelen aan veranderingen in Wnt en Hedgehog signalisatie en uiteindelijk aan een verstoring in het primair cilium. Dit is een verfijnd microtubulair sensorisch organel dat tot expressie komt op het oppervlak van bijna elk celtype en dat verloren gaat in vele kankers. SREBP1c-geïnduceerd verlies van het primair cilium werd bevestigd in zoogdiercellen en werd gemedieerd door veranderingen in de toevoer van vetzuren. Omgekeerd werd de vorming van het primair cilium hersteld wanneer de vetzuursynthese geïnhibeerd werd in sterk lipogene humane prostaatkankercellen. Het lipiden-geïnduceerde ciliair verlies was geassocieerd met een verkeerde localisatie van apicale proteïnen, een verstoring van celpolarisatie en een afwijkende epitheliale weefselontwikkeling, zoals aangetoond in 3D-culturen van MDCK cellen en in de ontwikkelende muisprostaat. Deze gegevens suggereren dat tumor-geassocieerde lipogenese de ciliumvorming verstoort en bijdraagt tot verminderde gewaarwording van de omgeving, abnormale signalisatie en verstoring van gepolariseerde weefselarchitectuur, wat allemaal kenmerken van kanker zijn. De bevindingen van deze thesis tonen aan dat de verhoogde lipogenese die in veel gevorderde kankers geobserveerd wordt, verschillende potentieel pro-tumorigene functies uitoefent die veel verder reiken dan de algemeen aangenomen rol als leverancier van lipiden voor snelle celdeling. Ze versterken ook het potentieel belang van het onderdrukken van deze metabole pathway als therapeutische interventie.status: publishe

Antiviral Activity of Chloroquine against Human Coronavirus OC43 Infection in Newborn Mice▿

Until recently, human coronaviruses (HCoVs), such as HCoV strain OC43 (HCoV-OC43), were mainly known to cause 15 to 30% of mild upper respiratory tract infections. In recent years, the identification of new HCoVs, including severe acute respiratory syndrome coronavirus, revealed that HCoVs can be highly pathogenic and can cause more severe upper and lower respiratory tract infections, including bronchiolitis and pneumonia. To date, no specific antiviral drugs to prevent or treat HCoV infections are available. We demonstrate that chloroquine, a widely used drug with well-known antimalarial effects, inhibits HCoV-OC43 replication in HRT-18 cells, with a 50% effective concentration (± standard deviation) of 0.306 ± 0.0091 μM and a 50% cytotoxic concentration (± standard deviation) of 419 ± 192.5 μM, resulting in a selectivity index of 1,369. Further, we investigated whether chloroquine could prevent HCoV-OC43-induced death in newborn mice. Our results show that a lethal HCoV-OC43 infection in newborn C57BL/6 mice can be treated with chloroquine acquired transplacentally or via maternal milk. The highest survival rate (98.6%) of the pups was found when mother mice were treated daily with a concentration of 15 mg of chloroquine per kg of body weight. Survival rates declined in a dose-dependent manner, with 88% survival when treated with 5 mg/kg chloroquine and 13% survival when treated with 1 mg/kg chloroquine. Our results show that chloroquine can be highly effective against HCoV-OC43 infection in newborn mice and may be considered as a future drug against HCoVs

Aberrant activation of fatty acid synthesis suppresses primary cilium formation and distorts tissue development

Aberrant activation of fatty acid synthesis is a key feature of many advanced human cancers. Unlike in classical lipogenic tissues, this process has been implicated in membrane production required for rapid cell proliferation. Here, to gain further insight into the consequences of tumor-associated fatty acid synthesis, we have mimicked the lipogenic phenotype of cancer cells in Xenopus embryos by microinjection of RNA encoding the lipogenic transcription factor sterol regulatory element binding protein 1c (SREBP1c). Dramatic morphologic changes were observed that could be linked to alterations in Wnt and Hedgehog signaling, and ultimately to a distortion of the primary cilium. This is a sophisticated microtubular sensory organelle that is expressed on the surface of nearly every cell type and that is lost in many cancers. SREBP1c-induced loss of the primary cilium could be confirmed in mammalian Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells and was mediated by changes in the supply of fatty acids. Conversely, inhibition of fatty acid synthesis in highly lipogenic human prostate cancer cells restored the formation of the primary cilium. Lipid-induced ciliary loss was associated with mislocalization of apical proteins, distortion of cell polarization, and aberrant epithelial tissue development as revealed in three-dimensional cultures of MDCK cells and in the developing mouse prostate. These data imply that tumor-associated lipogenesis, in addition to rendering cells more autonomous in terms of lipid supply, disturbs cilium formation and contributes to impaired environmental sensing, aberrant signaling, and distortion of polarized tissue architecture, which are all hallmarks of cancer

De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation.

Activation of de novo lipogenesis in cancer cells is increasingly recognized as a hallmark of aggressive cancers and has been implicated in the production of membranes for rapid cell proliferation. In the current report, we provide evidence that this activation has a more profound role. Using a mass spectrometry-based phospholipid analysis approach, we show that clinical tumor tissues that display the lipogenic phenotype show an increase in the degree of lipid saturation compared with nonlipogenic tumors. Reversal of the lipogenic switch in cancer cells by treatment with the lipogenesis inhibitor soraphen A or by targeting lipogenic enzymes with small interfering RNA leads to a marked decrease in saturated and mono-unsaturated phospholipid species and increases the relative degree of polyunsaturation. Because polyunsaturated acyl chains are more susceptible to peroxidation, inhibition of lipogenesis increases the levels of peroxidation end products and renders cells more susceptible to oxidative stress-induced cell death. As saturated lipids pack more densely, modulation of lipogenesis also alters lateral and transversal membrane dynamics as revealed by diffusion of membrane-targeted green fluorescent protein and by the uptake and response to doxorubicin. These data show that shifting lipid acquisition from lipid uptake toward de novo lipogenesis dramatically changes membrane properties and protects cells from both endogenous and exogenous insults. These findings provide important new insights into the role of de novo lipogenesis in cancer cells, and they provide a rationale for the use of lipogenesis inhibitors as antineoplastic agents and as chemotherapeutic sensitizers