Cloning, expression and purification of D-Tyr-tRNATyr-deacylase from Thermus thermophilus

D-Tyr-tRNATyr-deacylase (DTD) is a conservative enzyme, found in all domains of life, which ensures an additional checkpoint in the recycling of misaminoacylated D-Tyr-tRNATyr. DTD is capable of accelerating the hydrolysis of the ester linkage of D-Tyr-tRNATyr producing a free tRNA and D-tyrosine, thereby preventing an incorrect incorporation of D-amino acids into proteins. Deacylase distinguishes between D- and L-aminoacyl moieties and does not hydrolyze L-aminoacylated tRNA. The structural bases of this specificity and the mechanism of D-aminoacyl-tRNA hydrolysis are poorly understood. Aim. To clone D-Tyr-tRNATyr-deacylase from T. thermophilus (DTDTT), optimize the conditions for its expression in E.coli and develop an efficient purification procedure yielding the high quality enzyme suitable for the structural and functional studies. Methods. For amplification of DTD gene from T. thermophilus genomic DNA and its cloning into the pProEXHTb expression vector modern techniques were applied. Purification of the recombinant DTD protein was done with three types of column chromatography. His-tag was cleaved out from DTD by TEV protease. The cleavage was confirmed by Western blot analysis with anti-His-tag antibodies. Molecular weight of purified DTDTT was determined by the gel-filtration. Results. The expression construct pProEXHTb, containing DTD sequence from T. thermophilus, was obtained and successfully expressed in the BL21(DE3)pLysS E.coli strain. The protein of interest was purified to homogeneity by the combination of affinity (Ni-NTA), anion-exchange (Q-Sepharose) and size-exclusion (Superdex S 200) chromatographies. 2 mg of more than 90% pure recombinant DTD can be obtained from 1 L of bacterial culture. Molecular weight of purified DTD from T. thermophilus was determined to be 32 kDa, suggesting its dimeric structure. Conclusions. The pProEXHTb expression vector can be used for expression of DTD from T. thermophilus. The preparative amounts of DTD can be obtained after the three-step chromatographic procedures and used for further functional and structural studies.D-Тир-тРНКТир-деацилаза (DTD) є консервативним білком, знайденим у всіх царствах живої природи, що забезпечує додатковий корегувальний етап гідролізу помилково аміноацильованих субстратів D-Тир-тРНКТир DTD здатна приcкорювати гідроліз ефірного зв’язку в комплексі D-Тир-тРНКТир, утворюючи вільну тРНК та D-Тир, таким чином попереджуючи включення D-амінокислот до білків. Деацилаза розрізняє D- та L-аміноацильні залишки в аміноацильованій тРНК та не гідролізує останні. Структурні основи такої специфічності та механізм гідролізу D-аміноацил-тРНК за участі DTD є недостатньо зрозумілими. Мета. Клонувати D-Тир-тРНКТир-деацилазу з T. the­rmophilus (DTDTT), оптимізувати умов її експресії в E. coli, розробити ефективний метод очищення з високим виходом високоякісного ферменту, для структурних та функціональних досліджень. Методи. Ампліфікацію та клонування в pProEXHTb DTD гена геномної ДНК T. ther­mo­philus проведено за стандартними молекулярно-біологічними методами. Очистку рекомбінантного DTD білка проводено хроматографічно. Залишки гістидину відщеплено від DTD протеазою вірусу тютюну (TEV), ефективність реакції перевірено Вестерн-блот аналізом з анти-His-антитілами. Молекулярну масу очищеної DTDTT визначено гель-фільтрацією. Результати. Отримана конструкція pProEXHTb, що містить DTD послідовність з T. thermophilus, експресовано в E.coli штаму BL21(DE3)pLysS. Цільовий рекомбінантний білок виділено і очищено комбінацєю хроматографій: афінної (Ni-NTA), аніон-обмінної (Q-Sepharose) та гель-фільтрації (Superdex S 200) до чистоти 90%. Вихід рекомбінантної DTD склав 2 мг з одного літру культури. Визначена молекулярна маса очищеної DTD з T. thermophilus – 32 кДа свідчить на користь її димерної структури. Висновки. Отриманий вектор pProEXHTb, що містить DTD з T. thermophilus і підібрані умови очистки дозволяють отримати рекомбінантний DTD в кількостях достатніх для подальших структурно-функціональних досліджень.D-Тир-тРНКТир-деацилаза (DTD) является консервативным белком, найденным во всех царствах живой природы, обеспечивающим дополнительный корректирующий этап гидролиза ошибочно аминоацилированных субстратов D-Тир-тРНКТир. DTD ускоряет гидролиз эфирной связи в комплексе D-Тир-тРНКТир, предупреждая, таким образом, ошибочное включение D-аминокислот в белки. Деацилаза различает D- и L-аминоацильные остатки в аминоацилированной тРНК и не гидролизирует последние. Структурные основы такой специфичности и механизм гидролиза D-аминоацил-тРНК при участии DTD являются недостаточно изученными. Цель. Клонировать D-Тир-тРНКТир-деацилазу из T. thermophilus (DTDTT), оптимизировать условия её экспрессии в E. coli и разработать эффективный, с высоким выходом высококачественного фермента, метод очистки. Методы. Для амплификации и клонирования в pProEXHTb гена DTD геномной ДНК T. thermophilus использованы стандартные молекулярно-биологические методы. Очистку рекомбинантного DTD белка проводили хроматографически. Остатки гистидина отщепили протеазой вируса табака (TEV), еффективность реакции проверили Вестерн-блот анализом с анти-His-антителами. Молекулярный вес очищенной DTDTT определили гель-фильтрацией. Результаты. Полученная конструкция pProEXHTb, содержащая DTD последовательность T. thermophilus, экспрессирована в клетках E. coli штамма BL21(DE3)pLysS. Последовательными хроматографиями: афинной (Ni-NTA), анион-обменной (Q-Sepharose) и гель-фильтрации (Superdex S 200) получен гомогенный белок с чистотой более 90 %. Разработанная методика позволяет получить до 2 мг целевого белка / 1 л культуры. Определенный молекулярный вес очищенной DTD из T. thermophilus – 32 кДа свидетельствует о ее димерной структуре. Выводы. Полученная конструкция pProEXHTb, содержаащя DTD последовательность T. thermophilus и подобранные условия очистки позволяют получить рекомбинантный DTD для дальнейших структурно-функциональных исследований

Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27

Aim. To gain insight into structural and functional properties of alanyl-tRNA,synthetase (AlaRS), we genetically engineered constructs for expression and purification of full-length AlaRS and checked its activity in aminoacylation assays. Methods. The genomic DNA for the AlaS gene from the T. thermophilus (HB 27 strain) was amplified by PCR and cloned into vectors with and without a histidine tag. To optimize conditions for the protein expression in E. coli and to develop efficient purification procedure, the molecular biology techniques were applied. AlaRS was purified by affinity and size-exclusion chromatography. The molecular weight of enzyme was determined by gel filtration. Results. The expression and purification conditions for recombinant AlaRS were optimized. Approximately 1.5 mg of the pure active recombinant enzyme can be obtained from 1 L of bacterial culture. AlaRS from T. thermophilus is a dimer in solution with an experimental MW of 204 kDa. Conclusions. The purified recombinant enzyme will be used for further studies on the functional kinetics and structure of the crystal complex with tRNA.Мета. Для детального вивчення структурних та функціональних властивостей аланіл-тРНК-синтетази (АлаРС) було створено генно-інженерну конструкцію для експресії та очищення повнорозмірної синтетази та перевірено її активність у реакції аміноацилювання. Методи. Ген AlaS з T. thermophilus (штам HB27) геномної ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР з відповідними праймерами та клонували у вектор з та без гістидинової послідовності. Для оптимізації умов експресії білка в E.coli та розробки ефективної процедури очищення були застосовані сучасні методи молекулярної біології. AлаРС очищали методами афінної хроматографії та гель-фільтрації. Молекулярна маса ферменту визначалася на гель-фільтраційній колонці. Результати. Умови експресії та очистки рекомбінантної АлаРС були оптимізовані. Близько 1,5 мг чистого рекомбінантного активного ферменту можна одержати з 1 л бактеріальної культури. АлаРС з T. thermophilus є димером у розчині з експериментальною масою 204 кДа. Висновки. Отриманий рекомбінантний фермент буде використовуватися для подальших експериментів з функціональної кінетики та структурних досліджень кристалічного комплексу з тРНК.Цель. Для детального изучения структурных и функциональных свойств аланил-тРНК-синтетазы (АлаРС) было создано генно-инженерную конструкцию для экспрессии и очистки полноразмерной синтетазы и проверено ее активность в реакции аминоацилирования. Методы. Ген аlaS из геномной ДНК T. thermophilus (штамм HB27) амплифицировали с помощью ПЦР с соответствующими праймерами и клонировали в вектор с и без гистидиновой последовательностью. Для оптимизации условий экспрессии белка в E. coli и разработки эффективной процедуры очистки были применены современные методы молекулярной биологии. AлаРС очищали методами аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Молекулярная масса фермента определялась на гель-фильтрационной колонке. Результаты. Условия экспрессии и очистки рекомбинантной АлаРС были оптимизированы. Около 1,5 мг чистого рекомбинантного активного фермента можно получить с 1 л бактериальной культуры. АлаРС с T. thermophilus является димером в растворе с экспериментальной массой 204 кДа. Выводы. Полученный рекомбинантный фермент будет использован для дальнейших экспериментов с функциональной кинетики и структурных исследований кристаллического комплекса с тРН

Learning by Integrating Information Within and Across Fixations

Abstract. In this work we present a biologically inspired algorithm for learning object categories that uses Bayesian inference to integrate information within and across fixations. In our model, an object is represented as a collection of features of specific classes arranged at specific locations with respect to the location of the fixation point. Even though the number of feature detectors that we use is large, we show that learning does not require a large amount of training examples due to the fact that between an object and features we introduce an intermediate representation, object views, and thus reduce the dependence among the feature detectors. We tested the system on four object categories and demonstrated that the system can learn a new category from only a few training examples.

the interplay between cerebellum and basal ganglia in motor adaptation: A modeling study

Motor adaptation to perturbations is provided by learning mechanisms operating in the cerebellum and basal ganglia. The cerebellum normally performs motor adaptation through supervised learning using information about movement error provided by visual feedback. However, if visual feedback is critically distorted, the system may disengage cerebellar error-based learning and switch to reinforcement learning mechanisms mediated by basal ganglia. Yet, the exact conditions and mechanisms of cerebellum and basal ganglia involvement in motor adaptation remain unknown. We use mathematical modeling to simulate control of planar reaching movements that relies on both error-based and non-error-based learning mechanisms. We show that for learning to be efficient only one of these mechanisms should be active at a time. We suggest that switching between the mechanisms is provided by a special circuit that effectively suppresses the learning process in one structure and enables it in the other. To do so, this circuit modulates learning rate in the cerebellum and dopamine release in basal ganglia depending on error-based learning efficiency. We use the model to explain and interpret experimental data on error- and non-error-based motor adaptation under different conditions. © 2019 Todorov et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited

Reinforcement Learning for Decision Making in Sequential Visual Attention

Abstract. The innovation of this work is the provision of a system that learns visual encodings of attention patterns and that enables sequential attention for object detection in real world environments. The system embeds the saccadic decision procedure in a cascaded process where vi-sual evidence is probed at the most informative image locations. It is based on the extraction of information theoretic saliency by determining informative local image descriptors that provide selected foci of inter-est. Both the local information in terms of code book vector responses, and the geometric information in the shift of attention contribute to the recognition state of a Markov decision process. A Q-learner performs then explorative search on useful actions towards salient locations, devel-oping a strategy of useful action sequences being directed in state space towards the optimization of information maximization. The method is evaluated in experiments on real world object recognition and demon-strates efficient performance in outdoor tasks.