Modelagem molecular comparativa da enzima Adenilsuccinato Sintetase (ADSS) do parasito Schistosoma mansoni

A esquistossomose (barriga-d’água) é uma doença parasitária, crônica e que afeta cerca de 240 milhões de pessoas em todo mundo. O tratamento atual se resume na administração de um único fármaco, o praziquantel. Entretanto, seu uso extensivo culminou em baixas taxas de cura e casos de resistências do parasito a esse medicamento foram reportadas. Nesse contexto torna-se relevante a busca por novos fármacos contra a esquistossomose. O Schistosoma mansoni, parasito causador da doença, não possui a via de síntese de purinas, por isso depende integralmente da via de salvação de purinas para seu suprimento dessas bases. Diante disso, esta via tem sido citada como alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos contra a doença. O presente estudo teve como objetivo predizer a conformação da estrutura tridimensional da enzima adenilsuccinato sintetase (ADSS) que participa do metabolismo de purinas do parasito. A predição da estrutura foi obtida por meio da técnica de modelagem molecular comparativa, através de programas computacionais. A construção do modelo foi realizada pelo servidor Swiss-Model, enquanto a visualização, análise e validação da estrutura pelos softwares PyMol e PROCHECK. Para construir o modelo, sequencias semelhantes foram identificadas no Protein Data Bank e a estrutura da ADSS humana complexada com GDP foi selecionada como molde. As avaliações do modelo gerado demonstraram uma qualidade satisfatória e o modelo obtido mostrou que a estrutura tridimensional da ADSS do esquistossomo é conservada em relação à ADSS humana, com algumas substituições importantes ocorrendo na região do local de ligação do GDP: Ala423 por Lis447 e Ile365 por Val339. Com o intuito de se obter um inibidor seletivo à enzima do parasito e não efetivo quanto à enzima de humanos essas substituições sugerem que estudos de docagem sejam realizados para a seleção de inibidores específicos para a enzima ADSS do parasito para posterior testagem através de cinética enzimática

Modelagem molecular comparativa da enzima Adenilsuccinato Sintetase (ADSS) do parasito Schistosoma mansoni

A esquistossomose (barriga-d'água) é uma doença parasitária, crônica e que afeta cerca de 240 milhões de pessoas em todo mundo. O tratamento atual se resume na administração de um único fármaco, o praziquantel. Entretanto, seu uso extensivo culminou em baixas taxas de cura e casos de resistências do parasito a esse medicamento foram reportadas. Nesse contexto torna-se relevante a busca por novos fármacos contra a esquistossomose. O Schistosoma mansoni, parasito causador da doença, não possui a via de sí­ntese de purinas, por isso depende integralmente da via de salvação de purinas para seu suprimento dessas bases. Diante disso, esta via tem sido citada como alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos contra a doença. O presente estudo teve como objetivo predizer a conformação da estrutura tridimensional da enzima adenilsuccinato sintetase (ADSS) que participa do metabolismo de purinas do parasito. A predição da estrutura foi obtida por meio da técnica de modelagem molecular comparativa, através de programas computacionais. A construção do modelo foi realizada pelo servidor Swiss-Model, enquanto a visualização, análise e validação da estrutura pelos softwares PyMol e PROCHECK. Para construir o modelo, sequencias semelhantes foram identificadas no Protein Data Bank e a estrutura da ADSS humana complexada com GDP foi selecionada como molde. As avaliações do modelo gerado demonstraram uma qualidade satisfatória e o modelo obtido mostrou que a estrutura tridimensional da ADSS do esquistossomo é conservada em relação à ADSS humana, com algumas substituições importantes ocorrendo na região do local de ligação do GDP: Ala423 por Lis447 e Ile365 por Val339. Com o intuito de se obter um inibidor seletivo à enzima do parasito e não efetivo quanto à enzima de humanos essas substituições sugerem que estudos de docagem sejam realizados para a seleção de inibidores especí­ficos para a enzima ADSS do parasito para posterior testagem através de cinética enzimática

Modelagem molecular comparativa da enzima Adenosina Kinase isoforma 1 (AK1) de Schistosoma mansoni

O Schistosoma mansoni, parasito responsável pela esquistossomose mansônica, depende integralmente da via de salvação de purinas para o suprimento das bases púricas. Uma vez que o parasito não possui a via se sí­ntese dessas bases, a via de salvação representa um alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos. A adenosina kinase (AK) é uma das principais enzimas dessa via na sí­ntese direta de adesinosina monofosfato (AMP) a partir de adenosina. No genoma do parasito foram identificadas duas isoformas da AK, no entanto, apenas a estrutura tridimensional de SmAK2 (Smp_008360) foi resolvida experimentalmente. Assim, a modelagem comparativa foi utilizada como ferramenta para predizer a estrutura da isoforma SmAK1 (Smp_008400) e possibilitar a análise comparativa entre as duas estruturas. A modelagem foi realizada através do software Swiss-Model, o refinamento no 3Drefine, a validação no PDBsum, a observação e análise da estrutura e a comparação entre as isoformas no PyMOL. As estruturas tridimensionais da SmAK1 e SmAK2 possuem 80% de identidade e as sobreposições obtiveram RMSDs de 0.155 Å e de 0.167 Å atestando a similaridade do enovelamento entre ambas. Os modelos gerados possuem 343 resí­duos de aminoácidos e os gráficos de Ramachandran demonstram que 94,1% dos resí­duos estão em regiões favoráveis, 5,5% em regiões adicionalmente permitidas e 0,3% em regiões não permitidas garantindo a confiabilidade dos modelos gerados. As análises comparativas do sí­tio ativo da AK humana com relação a SmAK1, demonstram pouca variação nos aminoácidos que os constituem, como a substituição da Ser65 na AK humana pelo resí­duo equivalente Ala79 na SmAK1 e a não interação da adenosina com a Ala136 na humana, que corresponderia aos resí­duos funcionais Thr150 da SmAK1 e Thr136 da SmAK2 dos sí­tios ativos. Os resultados obtidos sugerem que dados de ensaios cinéticos com ligantes e possí­veis inibidores sejam realizados para complementar os dados obtidos e embasar conclusões sobre a viabilidade da enzima como alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos

Modelagem molecular de isoformas e docagem molecular da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) de Schistosoma mansoni

A esquistossomose é uma doença parasitária que afeta cerca de 240 milhões de pessoas em todo o mundo. Diferente de seu hospedeiro humano, o Schistosoma mansoni - parasito causador dessa doença, não possui a via metabólica de síntese de purinas e depende integralmente da via de salvação para suprimento dessas bases. Assim, esta via tem sido citada na literatura como alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que para o tratamento da doença, apenas um fármaco é utilizado, o praziquantel, e diversos casos de resistência do parasito a esse medicamento já foram reportadas. A HGPRT é uma das enzimas dessa via e catalisa a fosforibosilação reversível de hipoxantina e guanina para IMP (inosina monofosfato) ou GMP (guanosina monofosfato). Uma vez que no genoma do parasito foram identificadas três sequências que codificam para HGPRT e apenas uma das isoformas foi resolvida experimentalmente, a modelagem molecular por homologia foi realizada como forma preditiva para o estudo das estruturas ainda não resolvidas. A construção dos modelos foi realizada pelo servidor Swiss-Model; as visualizações, análises e validações pelos softwares UFSC-Chimera, PyMol e Procheck. Os modelos obtidos demonstraram qualidade satisfatória para as análises e enovelamento conservado entre as isoformas comparadas. Como ferramenta preditiva e de busca por possíveis inibidores para a enzima, foi realizada a docagem molecular na estrutura cristalográfica, elucidando comportamento e interação de pequenas moléculas no sítio ativo da enzima. Uma vez que esta foi resolvida complexada com IMP, a busca por ligantes se limitou a estruturas análogas ao mesmo e que possuíam potencial farmacológico. Para isso, foram utilizados quatro compostos da classe dos aciclonucleosídeos (acyclovir, adefovir, penciclovir e tenofovir) obtidos através do banco de dados PubChem. Os resultados da docagem foram avaliados quanto a sua pontuação e sua similaridade com o IMP, sugerindo que o penciclovir tem a maior afinidade com o sítio ativo e foi o segundo composto melhor pontuado pelo programa entre os testados. Os resultados obtidos contribuem para o planejamento de ensaios biológicos de atividade enzimática com os compostos docados e a resolução experimental das estruturas modeladas

Clube de Ciências Unespar e a formação inicial de professores de Ciências, Biologia e Química

A formação inicial de professores é um processo que deve garantir uma preparação de qualidade para garantir que estes profissionais estejam aptos a encarar os desafios recorrentes à docência. Nessa perspectiva, a formação restrita apenas aos cursos de licenciatura e os curtos estágios para prática docente nem sempre são suficientes para preparação adequada. Nesse sentido, faz-se necessário recorrer à alternativas para complementação da formação e prática. Como alternativa apresentam-se os projetos de extensão, que possibilitam aos acadêmicos o desenvolvimento de habilidades que vinculam o ensino e a pesquisa com a prática através do contato direto com outros setores da sociedade. Este trabalho apresenta a reflexão sobre as experiências de acadêmicos dos cursos de Licenciatura em Ciências Biológicas e Quí­mica, da Universidade Estadual do Paraná – UNESPAR campus União da Vitória, participantes do projeto de extensão "Clube de Ciências UNESPAR" no perí­odo de fevereiro de 2018 a novembro de 2019. O objetivo do projeto foi aproximar os alunos das escolas públicas do municí­pio e região do ambiente universitário promovendo a democratização do conhecimento. Além disso, oportunizar aos acadêmicos a complementação da prática docente através da elaboração e promoção das oficinas com os alunos participantes, promovendo o protagonismo estudantil e o desenvolvimento de habilidades como liderança, segurança, facilidade de trabalho em grupo, criatividade e dinamismo

Studies of adenosine kinase isoform 1, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase isoforms 1, 2 and 3, adenylosuccinate lyase, adenylosuccinate synthetase enzymes from Schistosoma mansoni

O Schistosoma mansoni, parasita responsável pela esquistossomose (barriga dágua), doença que afeta cerca de 300 milhões de pessoas em todo mundo, não possui a via de síntese de purinas, dependendo integralmente da via de salvação de purinas para seu suprimento dessas bases. Uma vez que a terapia se resume a administração de um único fármaco, o praziquantel, diversos casos de resistência do parasita a esse medicamento foram reportadas, sendo assim esta via tem sido citada como alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos contra a doença. As enzimas adenosina kinase (AK), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT), adenilsuccinato liase (ADSL) e adenilsuccinato sintetase (ADSS) são enzimas chave desta via. Este trabalho faz parte de um projeto maior que visa a obtenção de todas as estruturas das enzimas envolvidas na via de salvação de purinas de Schistosoma mansoni. O cDNA correspondente às enzimas foi amplificado e clonado no vetor de expressão pOPIN; as enzimas AK isoforma 1, HGPRT isoforma 1 e ADSL foram expressas em E. coli Lemo21(DE3) e HGPRT isoforma 3 em E. coli B834(DE3); purificadas em coluna de cobalto agarose por afinidade, concentradas e cristalizadas no kit de cristalização Morpheus (Molecular Dimensions) no Oxford Protein Production Facility (OPPF) em Harwell UK. As coletas de dados por difração de raio-X foram realizadas no Síncrotron Diamond Light Source (DLS) - UK. Foram coletadas duas estruturas de ADSL, a 2.36Å de resolução em complexo com AMP e 2.14Å na forma Apo. A análise das estruturas revelou uma estrutura tetramérica bastante conservada entre as ADSLs, sendo este estado de oligomerização requerido, uma vez que resíduos de três das quatro subunidades compõem o sítio ativo. Apesar do sítio ativo ser altamente conservado entre SmADSL e ADSL humana, a interface dimérica dessas enzimas tem se apresentado suficientemente distintas, o que pode representar um potencial alvo para o desenvolvimento de um inibidor. O ensaio de atividade enzimática de ADSL revelou uma reação endotérmica, indicando que a contribuição da entropia relacionada a grande quantidade de moléculas de água presentes no sítio ativo é importante para a reação cinética. Após diversos experimentos de otimização dos cristais de HGPRT1 e aproximadamente 200 cristais testados, foi obtida uma estrutura em complexo com IMP a 2.8Å de resolução. A análise da estrutura revelou uma estrutura tetramérica. Apesar das subunidades não compartilharem o sítio ativo, este estado de oligomerização é requerido, uma vez que resíduos que compõem o sítio ativo também estão envolvidos em interações na interface dimérica, orientando o resíduo invariável Arg206 na direção do sítio ativo. Foram identificadas quatro mutações na região do sítio ativo entre SmHGPRT e HGPRT humana: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e Arg192Lys. Desta forma, a obtenção das estruturas contribui para o entendimento bioquímico desta via essencial para o parasita e de como este pode ser seletivamente privado de recursos.Schistosoma mansoni is the parasite responsible for schistosomiasis, disease that affects about 300 million people worldwide, and does not have the purine de novo pathway, depending entirely on the purine salvage pathway to supply its demands on purines. Currently, both direct treatment and most disease control initiatives, rely on chemotherapy using a single drug, praziquantel. Concerns over the possibility of resistance developing to praziquantel, has stimulated efforts to develop new drugs for the treatment of schistosomiasis. The purine salvage pathway has been reported as a potential target for developing new drugs against schistosomiasis. Adenosine kinase (AK), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT), adenylosuccinate lyase (ADSL), adenylosuccinate synthetase (ADSS) are key enzymes in this pathway. This work is part of a larger project aimed at obtaining all the structures of enzymes involved in purine salvage pathway of Schistosoma mansoni. The cDNA corresponding to the enzymes was amplified and cloned in vector pOPIN, AK isoform 1, HGPRT isoform 1 and ADSL were expressed in E. coli Lemo 21 (DE3) and HGPRT isoform 3 in E. coli B834(DE3); purified in cobalt agarose column, concentrated and crystallized in several conditions of the Morpheus (Molecular Dimensions) crystallization kit at the Oxford Protein Production Facility (OPPF) in Harwell UK. The data collection by xray diffraction were performed at Diamond Light Source UK. Two ADSL structures were obtained, ADSL in complex with AMP at 2.36Å resolution and ADSL Apo form at 2.14Å The analysis revealed a tetrameric structure highly conserved between ADSLs, and this oligomerization state is required since residues three of the four subunits comprise the active site. Despite the active site being highly conserved between human ADSL and SmADSL, the dimeric interface of these enzymes it has been shown sufficiently distinct, which may represent a potential target for the development of an inhibitor. The ADSL enzymatic activity assay showed an endothermic reaction, indicating the contribution of the entropy related to the large quantity of water molecules present in the active site is important for the reaction kinetics. After several optimization experiments of HGPRT1 crystals and about 200 crystals tested was obtained a structure in complex with IMP at 2.8Å resolution. The structure analysis revealed a tetrameric structure. Despite the subunits do not share the active site, this oligomerization state is required, since residues that make up the active site are also involved in interactions in dimeric interface, guiding the invariable residue Arg206 toward the active site. Four mutations were identified in the region of the active site between SmHGPRT and human HGPRT: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e Arg192Lys. These structures increase the important structural information available about the Schistosoma mansoni purine salvage pathway and how it can be selectively private resources

Estudos das enzimas adenosina kinase e hipoxantinaguanina fosforibosiltransferase de Schistosoma mansoni

Schistosoma mansoni is the parasite responsible for schistosomiasis mansonica, a disease that affects about 207 million people worldwide, and does not have the purine de novo sinthetic pathway, depending entirely on the purine salvage pathway to supply its demands on purines. Adenosine kinase (AK) and Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) are important enzymes of the purine salvage, the AK directly phosphorylates adenosine into adenosine monophosphate (AMP) and HGPRT is responsible for the reversible phosphorybosylation of hypoxanthine or guanine into IMP or GMP. The purine salvage pathway has been reported as a potential target for developing new drugs against schistosomiasis. The nucleotide coding region of the isoform 2 of AK enzyme was amplified and cloned into pGEM vector and pET28a, the recombinant protein was expressed in E.coli BL21 (DE3), purified in a his-tag nickel-affinity resin and AMP-agarose resin, tested for its activity and crystallized. Two data sets were obtained by X-ray diffraction: a ternary complex of AK2-AMP-adenosine in the MX2 light line of the Synchrotron Light National Laboratory and a binary complex AK2-tubercidin in the rotatory anode X-ray source of the Institute of Physics at Sao Carlos - USP, both at 2.3A of resolution. The nucleotide coding region of the enzyme HGPRT was also amplified, cloned into pGEM and pET28a, which heterologous expression was done in E.coli BL21 (DE3) cells at 18°C and purified on a cobalt his-tag affinitiy resin.Universidade Federal de Minas GeraisSchistosoma mansoni e o parasita responsavel pela esquistossomose mansonica, doenca que afeta cerca de 207 milhoes de pessoas em todo mundo, e nao possui a via de sintese de novo de purinas, dependendo integralmente da via de salvacao para seu suprimento de purinas. A adenosina kinase (AK) e a Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) sao importantes enzimas desta via, sendo a AK responsavel pela fosforilacao direta de adenosina para adenosina monofosfato (AMP) e a HGPRT pela fosforibosilacao reversivel de hipoxantina ou guanina para IMP ou GMP respectivamente. Essa via tem sido citada como alvo potencial para o desenvolvimento de novos farmacos contra a esquistossomose. A regiao nucleotidica codificadora da enzima AK, isoforma 2, foi amplificada e clonada em vetor pGEM e pET28a, a proteina recombinante foi expressa em E.coli BL21 (DE3), purificada em coluna de niquel e AMP-agarose, submetida a ensaios de atividade e cristalizada. Dois conjuntos de dados foram obtidos por difracao de raio-X: um complexo ternario de AK2- AMP-adenosina na linha de luz MX2 do Laboratorio Nacional de Luz Sincrotron e um complexo binario de AK2-tubercidina no raio-X do Instituto de Fisica de Sao Carlos USP anodo rotatorio, ambos a 2.3A de resolucao. A regiao nucleotidica codificadora da enzima HGPRT tambem foi amplificada, clonada em pGEM e pET28a, sendo a proteina recombinante expressa em E.coli BL21 (DE3) a 18°C e purificada em coluna de cobalto

Análise microbiológica de bactérias patogênicas em areias de praças públicas no município de União da Vitória - Paraná

As bactérias são um grupo de microrganismos extremamente difundido que habitam os mais diferentes locais. Apesar da grande maioria não ser patogênica, algumas cepas podem representar grande problema de saúde pública, como as superbactérias. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi realizar análise microbiológica em amostras de areias de quatro praças públicas (A, B, C e D) no perímetro urbano central da cidade de União da Vitória-PR destinadas à recreação a fim de verificar a existência de bactérias patogênicas. As amostras foram coletadas no mês de dezembro de 2017 e o método adotado para a análise foi cultura em meio Ágar sangue seguido de provas bioquímicas. No ponto B foi identificada apenas a existência da bactéria Pseudomonas putida, uma bactéria de solo que não é classificada como patogênica. No ponto D também foi identificado apenas uma bactéria, do gênero Bacillus. No ponto A além das bactérias Bacillus sp.e Pseudomonas putida, foi identificada também a existência de Pseudomonas aeruginosa, uma bactéria comum em ambiente hospitalar amplamente reportada como causadora de infecções nosocomiais. O registro recorrente de cepas de Bacillus sp.e Pseudomonas putida foi observado no ponto C. Além destas,exemplares da família enterobacteriaceae, incluindo Escherichia coli e Enterococcus faecalis também foram identificadas. As bactérias E. coli e E. faecalis podem causar infecções do trato urinário,  meningites e endocardites, e são bactérias comumente encontradas em fezes, indicando a possível contaminação da areia com fezes humanas ou de animais. A partir desses resultados pode-se concluir que a presença dessas bactérias potencialmente patogênicas nas areias das praças A e C indicam que estas representam focos de contaminação com considerável risco de infecção, principalmente para crianças, idosos e indivíduos imunossuprimidos.

Análise microbiológica de bactérias patogênicas em areias de praças públicas no municí­pio de União da Vitória - Paraná

As bactérias são um grupo de microrganismos extremamente difundido que habitam os mais diferentes locais. Apesar da grande maioria não ser patogênica, algumas cepas podem representar grande problema de saúde pública, como as superbactérias. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi realizar análise microbiológica em amostras de areias de quatro praças públicas (A, B, C e D) no perí­metro urbano central da cidade de União da Vitória-PR destinadas à recreação a fim de verificar a existência de bactérias patogênicas. As amostras foram coletadas no mês de dezembro de 2017 e o método adotado para a análise foi cultura em meio Ágar sangue seguido de provas bioquí­micas. No ponto B foi identificada apenas a existência da bactéria Pseudomonas putida, uma bactéria de solo que não é classificada como patogênica. No ponto D também foi identificado apenas uma bactéria, do gênero Bacillus. No ponto A além das bactérias Bacillus sp.e Pseudomonas putida, foi identificada também a existência de Pseudomonas aeruginosa, uma bactéria comum em ambiente hospitalar amplamente reportada como causadora de infecções nosocomiais. O registro recorrente de cepas de Bacillus sp.e Pseudomonas putida foi observado no ponto C. Além destas,exemplares da famí­lia enterobacteriaceae, incluindo Escherichia coli e Enterococcus faecalis também foram identificadas. As bactérias E. coli e E. faecalis podem causar infecções do trato urinário, meningites e endocardites, e são bactérias comumente encontradas em fezes, indicando a possí­vel contaminação da areia com fezes humanas ou de animais. A partir desses resultados pode-se concluir que a presença dessas bactérias potencialmente patogênicas nas areias das praças A e C indicam que estas representam focos de contaminação com considerável risco de infecção, principalmente para crianças, idosos e indiví­duos imunossuprimidos