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Pathogenic potential of human isolates of Aliarcobacter butzleri
Since its discovery in 1991, the Aliarcobacter genus comprises 11 recognized species,
including Aliarcobacter butzleri. This species has been described as a pathogen, being
the fourth Campylobacter-related microorganism most commonly found in human
diarrheic samples. Infections by this bacterium are often associated with abdominal
cramps, nausea and watery diarrhoea. Although some studies described its pathogenic
potential, still not much is known about its virulence mechanisms, which can
complicate the treatment of infections caused by this microorganism and its control. In
this manner, this work aimed to evaluate the different virulence phenotypic profiles of
fifteen human isolates of A. butzleri. Initially, all isolates were typed by Multilocus
Sequence Typing, which showed that all isolates belonged to different sequence types,
pointing towards the genetic diversity of this bacterium. Next, several assays were
performed to characterize the virulence phenotypic profile of each clinical isolate by
assessing: (i) the antimicrobial profile through determination of the minimum
inhibitory concentration (MIC) of six antibiotics of distinct classes; (ii) the
susceptibility to reactive oxygen and nitrogen species; (iii) survival in acidic conditions
(pH 4); (iv) the presence of the urease enzyme; (v) the resistance to bile salts; (vi) the
chemotactic profile of each strain; (vii) the motility; (viii) differences in morphotype;
(ix) biofilm formation ability; (x) haemolytic activity; (xi) survival in human serum; and
(xii) the interaction between A. butzleri with the human colorectal adenocarcinoma cell
line, Caco-2. Although, the clinical A. butzleri isolates under study, showed similar
oxidative and nitrosative stress responses and morphotype, it was observed a great
phenotypic variety among the isolates. Various isolates showed a multidrug resistance
profile, with higher resistance frequency being observed for the antibiotics: ertapenem
(100%), tetracycline (93.3%), and ampicillin (86.6%). Considering the potential
survival of the isolates through the gastrointestinal system, the isolates demonstrated
diverse resistance profiles against acidic conditions, with six strains having a positive
phenotype for the presence of the urease enzyme, but all demonstrated to be resistant
do the bile salts concentrations found in the human gut. Distinct chemotactic profiles
indicating a possible interaction with compound of the human mucosa were observed.
The isolates under study demonstrated low motility or a diverse profile of higher
motility, and different profiles of biofilm formation classified from weak to strong
biofilm formers. The A. butzleri isolates showed weak haemolytic activity and low
survival in the human serum, with exception of one. Only seven strains demonstrated
to be capable of invading Caco-2 cells, while all showed to be adherent to the cell line
despite at different levels. The effect of aerobic conditions in the phenotype has also been studied on three isolates
presenting distinct phenotypic profiles (INSA Cu 29393, INSA 3202 e INSA 3711). To
evaluate the differences in the phenotypic profile when subjected to different
atmospheric conditions (aerobiosis and microaerophilia), a similar characterization to
the one done for assessment of the phenotypic profile of the clinical isolates was
performed. Overall, the aerobic conditions seemed to have a positive effect in the
haemolytic activity and motility of the isolates, although having no impact on the
flagellin A expression. Further, the aerobic conditions also negatively affected the
oxidative stress resistance of the isolates, with the remaining assays showing a strainspecific response.
In conclusion, taking into account the results obtained, we can acknowledge that a
great phenotypic variability can be found among the clinical isolates of A. butzleri
studied, which may be associated with a different host-bacterium interaction.Desde a sua descoberta em 1991 até aos dias de hoje, o género Aliarcobacter
compreende cerca de 11 espécies reconhecidas, incluindo Aliarcobacter butzleri. Esta
espécie é descrita como um enteropatogéneo emergente, sendo o quarto organismo
relacionado com Campylobacter mais frequentemente encontrado em fezes diarreicas
no ser humano. Infeções por esta espécie são ainda associadas a dores abdominais,
náuseas e diarreia aquosa. Devido não só à sintomatologia associada a esta bactéria,
mas também à sua grande prevalência na cadeia alimentar, esta espécie foi desde 2002
incluída na lista de microrganismos considerados um sério risco para a saúde humana
pela Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos. Apesar
de alguns estudos descreverem o potencial patogénico de A. butzleri, ainda pouco se
sabe sobre os mecanismos virulência deste patógeno, o que pode dificultar o
tratamento de infeções causadas pelo mesmo e o seu controlo. Assim, este trabalho teve
como objetivo avaliar os diferentes perfis fenotípicos de virulência de quinze isolados
de A. butzleri com origem em fezes humanas.
Inicialmente, os isolados foram distinguidos usando tipagem por sequenciação de
múltiplos loci (MLST, do inglês Multilocus Sequence Typing), verificando-se que todos
os isolados pertenciam a diferentes sequência-tipo (ST), caracterizando-se então por
serem geneticamente distintos. Os resultados também apontaram para a alta
variabilidade genética que já tem sido descrita nesta bactéria. Em seguida, vários
ensaios foram realizados de modo a caracterizar o perfil de fenotípico de virulência de
cada isolado clínico.
O perfil de resistência a antimicrobianos tem sido considerado como um elementochave na caracterização de agentes patogénicos, possibilitando o uso de um tratamento
correto face a uma infeção bacteriana. Neste trabalho, o perfil de resistência para as
estirpes em estudo foi realizado através da determinação das concentrações mínima
inibitórias de seis antibióticos pertencentes a diferentes classes (ampicilina,
ciprofloxacina, tetraciclina, eritromicina, gentamicina e ertapenemo). Esta
determinação foi realizada através de difusão em agar com exceção do ertapnemo que
foi realizado usando um ensaio de difusão em disco. Os isolados apresentaram seis
perfis distintos de resistência, com frequências de resistência superiores para o
ertapenemo (100%), a tetraciclina (93,3%) e a ampicilina (86,6%), sendo que a maioria
dos isolados apresentou um perfil de multirresistência.
Espécies reativas de oxigénio bem como espécies reativas de azoto estão presentes no
meio ambiente, mas são também usadas pelo sistema imunitário do hospedeiro de modo a proteger-se contra infeções bacterianas. De modo a avaliar a resposta dos
isolados clínicos de A. butzleri, o perfil de resistência aos stresses oxidativo e
nitrosativo foi avaliado usando ensaios de difusão em disco, contendo peróxido de
hidrogénio, metil de viologénio ou nitroprussiato de sódio. Os isolados clínicos
analisados, apresentaram perfis de resistência semelhantes com pequenas variações de
suscetibilidade na presença de metil de viologénio e peróxido de hidrogénio a 3%
(stress oxidativo), enquanto nenhuma dos estipes se demonstrou sensível à presença do
nitroprussiato de sódio (stress nitrosativo). De seguida de modo a tentar perceber como
é que A. butzleri é capaz de chegar ao intestino para causar infeção, avaliou-se um
conjunto de fatores que estão potencialmente associados com a sobrevivência no trato
gastrointestinal. Assim, a sobrevivência em ambiente acídico foi estudada por
incubação de cada isolado durante uma hora a pH 4; avaliou-se a presença da enzima
urease através da avaliação da sua atividade usando meio contendo ureia, e a
resistência a sais biliares por determinação da sua concentração mínima inibitória. Em
relação à sobrevivência em pH 4, pôde-se verificar que cinco dos isolados se
demonstraram mais sensíveis ao pH ácido, enquanto as restantes apresentaram
diferentes níveis de resistência. Também foi verificada a presença de fenótipo positivo
para a presença da urease em seis estirpes de A. butzleri, embora não tenha sido
correlacionado com a resistência ao ácido. Em relação à resistência aos sais biliares,
todas as estirpes demonstraram ser resistentes às concentrações descritas para o
intestino humano.
Para avaliar a quimiotaxia relacionada com as estirpes, a caracterização do perfil
quimiotático dos isolados foi analisada usando nove compostos diferentes
representando compostos tais como: hidratos de carbono, aminoácidos e ácidos
orgânicos. Todos os isolados apresentaram distintos perfis quimiotáticos, sugerindo
uma possível quimioatração por componentes da mucosa intestinal. Considerando que
a motilidade confere uma vantagem no processo de infeção, a motilidade foi também
avaliada nos isolados clínicos de A. butzleri. Esta característica foi então determinada
por inoculação em placas de meio com 0,4 % (m/v) de agar, seguido de incubação
durante 48 h e posterior medição do halo. Os isolados apresentaram dois perfis
distintos, um em que seis isolados apresentaram baixa motilidade e outro grupo mais
heterogéneo com valores moderados e altos de motilidade. Para observar possíveis
diferenças no morfótipo e produção celulose de cada isolado, a morfologia das colónias
de cada estirpe foi observada em placas suplementadas Congo red e azul brilhante de
Coomassie, bem como em placas suplementadas com Calcoflour white,
respetivamente. Após análise, todos os isolados parecem apresentar o morfótipo Bdar (do inglês: “brown, dry and rough”), sugerindo a potencial presença de fimbrias e a
ausência de produção de celulose.
A capacidade de formação de biofilmes também tem sido descrita como um importante
fator na sobrevivência tanto no ambiente como no hospedeiro, sendo capaz de
aumentar a resistência ao sistema imunitário e à presença de antibióticos. Para avaliar
a capacidade de formação de biofilmes foi usada a metodologia de coloração com
violeta de cristal usando placas de 24 poços. Na sua maioria, os isolados apresentaram
moderada a alta capacidade de formação de biofilme.
A presença de hemolisinas tem sido reportada em A. butzleri, as quais podem conferir
às estirpes capacidade hemolítica, sendo capazes de induzir lise de eritrócitos. Para
verificar a atividade hemolítica, os isolados foram incubados com eritrócitos humanos.
Todos os isolados demonstraram uma capacidade hemolítica fraca, no entanto
verificou-se a existência de dois isolados com perfil distinto apresentando valores de
capacidade hemolítica superiores. Em A. butzleri foi já sugerido um papel do soro
humano na sua natureza limitante durante a infeção, sendo assim relevante perceber o
comportamento desta bactéria em soro. A sobrevivência no soro humano foi realizada
pela incubação com os isolados durante um período de uma hora, onde maior parte dos
isolados se apresentaram como sensíveis ao soro humano após 20 minutos de
incubação.
Por fim, de modo a estudar a interação bacteriana com a linha de células de
adenocarcinoma colorretal humano, Caco-2 (capacidade de adesão e invasão), a linha
celular foi infetada com cada isolado clínico de A. butzleri com uma multiplicidade de
infeção de 200. Todas as estirpes demonstraram ser capazes de aderir a esta linha
celular, mas apenas sete isolados apresentaram capacidade de invasão celular.
A. butzleri tem sido descrito como aerotolerante, no entanto exposição a elevados
níveis de oxigénio pode ser capaz de induzir stress. Para avaliar os efeitos da exposição
a condições de aerobiose, três isolados com perfis fenotípicos diferentes (INSA Cu
29393, INSA 3202 e INSA 3711) foram selecionados para mais estudos. Para avaliar as
possíveis diferenças de perfil fenotípico dos isolados de A. butzleri quando sujeitos a
diferentes condições atmosféricas (aerobiose e microaerobiose) foram realizados
ensaios de avaliação da resistência aos stresses oxidativo e nitrosativo, sobrevivência
em meio ácido, sobrevivência em soro humano, motilidade, capacidade de formação de
biofilme, capacidade hemolítica e capacidade de adesão e invasão em linhas celulares
Caco-2. De forma geral, as condições aeróbicas parecem favorecer a capacidade
hemolítica e a motilidade dos isolados, apesar de não modificarem a expressão relativa
da flagelina A. Para além disso, quando em aerobiose parece ocorrer um
desfavorecimento da resistência ao stress oxidativo, e não se observa impacto na invasão a células do hospedeiro. Nos restantes ensaios foram obtidos resultados
variáveis dependentes do isolado em estudo.
Em suma, tendo em conta os resultados obtidos, podemos afirmar que existe uma
grande variabilidade fenotípica entre os isolados clínicos de A. butzleri estudados, e que
muitos dos mecanismos associados às suas características associadas a virulência
continuam por explorar
The role of lease financing
Leasing has become, throughout recent years, an increasingly important financing source for companies’ operational activities and has deserved some attention in the corporate finance literature. Understanding the leasing decision, through a comparison with other external financing options and an evaluation of its overall fit with firms’ specific characteristics has been the focus of existing investigations and it is the goal of this study. Our analysis is focused on the relationship between lease and debt financing and on an examination of firms’ leasing propensity, taking into account their particular features. With the adoption of three different, but complementary methodologies, we find that leasing propensity is greater for smaller firms, with more investment opportunities, in a worst financial condition, with relatively fewer specific assets and with lower availability of collateral. In addition, results suggest that lease and debt financing are seen as substitutes, as higher relative amounts of debt are associated with lower leasing intensity
Fast vanishing cycles on perturbations of (complex) weighted-homogeneous germs
Let X_o be a complex weighted-homogeneous complete intersection germ,
(possibly non-reduced). Let X be a perturbation of X_o by
``higher-order-terms". We give sufficient criteria to detect fast cycles on X,
via the weights of X_o. This is an easy obstruction to be non-metrically
conical.
A simple application of our results gives, e.g.
* Suppose the germs X_o,X,X\cap V(x_1) are ICIS. If X is IMC then the n
lowest weights of X_o coincide.
* Let the surface germ X=V(f)\subset (C^3,o) be Newton-non-degenerate and
IMC. Then for each of the faces of the Newton diagram the two lowest weights
coincide.
As an auxiliary result we prove (under certain assumptions, for \k=\R,\C):
the weighted-homogeneous foliation of the pair X_o \sset (\k^N,o) deforms to a
foliation of the pair X \sset (\k^N,o). In particular, the deformation by
higher order terms is ambient-trivializable by a semialgebraic Lipschitz
homeomorphism
Multi--Lipschitz equivalence in dimension two
In this paper, we study Multi--equivalence of multi-germs of
functions on the plane, definable in a polynomially bounded o-minimal
structure. We partition the germ of the plane at origin into zones of arcs in
such a way that it produces a non-Archimedean space (set of orders and width
functions) compatible with a given multigerm, encoding its asymptotic
behaviour. Such a partition is called Multipizza. We show the existence,
uniqueness and complete invariance of Multipizzas with respect to the
Multi--Lipschitz equivalence.Comment: 11 page
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