Implantação de métodos para detecção de proteínas de membrana de eritrócitos infectados por plasmodium falciparum como possíveis alvos da resposta imunológica distinta em pacientes assintomáticos para malária

Dissertação apresentada ä Universidade Federal de Rondônia - UNIR, para a obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental do Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental.Mesmo após 130 anos da descoberta do agente causador da malária, cerca de 250 milhões de pessoas, com aproximadamente 1 milhão de mortes, ainda são acometidas por malária todos os anos. Na tentativa de encontrar uma forma de alterar este cenário, este trabalho buscou subsídios através de metodologias para detecção de proteínas da membrana de hemácias infectadas por Plasmodium falciparum, com diferentes determinantes imunoquímicos relevantes para a resposta imunológica humoral diferencial em pacientes assintomáticos. Realizou-se uma comparação, através de eletroforese e western blot, do perfil de imunorreatividade para diferentes tipos de soros de pacientes infectados nas condições clínicas evidentes sintomáticas e assintomática. Foi padronizado o método de separação por eletroforeses uni- e bi-dimensional, bem como o método de identificação de proteínas imunorreativas por western blot. Os resultados obtidos mostraram uma grande diferença do perfil de resposta imunológica entre indivíduos sintomáticos e assintomáticos. Foram marcadas proteínas da membrana de eritrócitos infectados por P. falciparum imunorreativas para soro de paciente assintomático, que, após processo de identificação poderão ser úteis para o entendimento da aquisição da proteção humoral em pacientes assintomáticos. Em eletroforese 2D, observou-se um grande número de spots, mostrando que este método é útil e será utilizado para separação destas proteínas de interesse para identificação futura. Além disso, a técnica de western blot associada a separação em 2D, revelou um número de proteínas imunorreativas maior, quando comparado com aquele proveniente da eletroforese unidimensional. A importância do reconhecimento por anticorpos das proteínas e sua relação a proteção/suscetibilidade de doadores de plasma é discutida

Estudo da variação ontogenética do veneno de Bothrops atrox por análise proteômica e peptidômica: Identificação de peptídeos potencializadores de bradicinina

Tese apresentada à Universidade Federal de Rondônia - UNIR, para a obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental.Os acidentes com serpentes na Amazônia são causados na sua maioria, cerca de 90%, por Bothrops atrox, com rápida evolução hemorrágica e morte tecidual. A caracterização ontogenética dos espécimes estudados mostram a relevância do acidente ofídico negligenciado, que produz indivíduos com sequelas ou danos físicos irreparáveis pela ineficácias das terapias utilizadas atualmente. Deste modo, a compreensão das diferenças moleculares entre os venenos de serpentes de uma determinada região geográfica, no caso Porto Velho-RO, são de extrema importância na prepação de bioativos antiofídicos para diminuir os danos e sintomas fisiológicos que a peçonha de serpente causa. Por outro lado, as diferenças protéicas podem contribuir para a descoberta de protótipos de interesse biológico e/ou da medicina. Neste trabalho investigamos a possível variação ontogenética dos venenos de Bothrops atrox (adultas, jovens e de filhotes na localidade de Porto Velho-RO) por cromatografia de fase reversa em coluna C-18, cromatografia de exclusão molecular, eletroforese mono e bidimensional, espectrometria de massa (MALDI) e atividades biológicas: miotóxica, hemolítica, hemorrágica, pró-coagulante e coagulante; evidenciando-se a variação ontogenética dos espécimes desta região da Amazônia brasileira. Os venenos de jovens e filhotes analisados apresentaram maior atividade fosfolipásica (hemolítica), hemorrágica, miotóxica, coagulante e atividade pró-coagulante sobre substrato cromogênico, em relação aos indivíduos adultos. As proteínas do veneno desta espécie, apareceram em géis bidimensionais, em condições não redutoras, com bandas protéicas nas faixas moleculares de 92, 52, 37 e 21 kDa. Os perfis cromatográficos destes venenos, monstraram variações quanto aos tempos de retenção e proteínas expressas nas amostras, diferenciando-se dos demais perfis de Bothrops atrox já estudados, avalizando a variação geográfica e ontogenética que ocorre com o gênero Bothrops distribuído por toda Amazônia legal. Identificou-se por homologia quatro novos peptídeos potencializadores de bradicinina (BPPs), nos venenos de B. atrox Adulta e Jovem, os quais apresentaram massas de 691,21; 1074,99; 1116,54; 1146,55 e 1384,7386 m/z, sendo o BPP de maior massa sequenciado por sequenciamento de novo, para o qual obteve-se os seguintes resíduos de aminoácidos: ZKWPRPGPEIPP, denominado de BAX12

Caracterização de fosfolipases A2 da peçonha de Bothrops bilineata e identificação do gene de inibidores de fosfolipases A2 de classe gama em Bothrops atrox e Micrurus lemniscatus: um estudo com ênfase no potencial biotecnológico.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação: Mestrado em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR) como requisito final para a obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Guerino Stábeli.A Amazônia representa a maior concentração e diversidade de espécies de serpentes do território brasileiro. No entanto, o conhecimento científico, dos componentes de venenos e secreções da maioria destas espécies ainda é desconhecido. Várias moléculas ativas presentes nos venenos de serpentes são alvos de estudo, inclusive para protótipos de novos fármacos. Entre elas estão as fosfolipases A2, uma superfamília de enzimas com atividade na membrana celular e também envolvidas em diversos processos fisiopatológicos no envenenamento. O presente estudo teve como objetivo analisar o potencial biotecnológico relacionado às fosfolipases A2 de três serpentes endêmicas na região amazônica: Bothrops bilineata, Bothrops atrox e Micrurus lemniscatus. A Bothrops bilineata é uma serpente considerada rara, e pouco se conhece cientificamente. Por isso, desperta interesse pela intensa toxicidade que o veneno possui nos casos ofídicos registrados. As alterações miotóxicas ocasionadas por esse veneno foram avaliadas mensurando os níveis séricos de creatina cinase. O veneno da B. bilineata ocasionou mionecrose intensa nos camundongos avaliados. Além disso, apresentou elevada atividade fosfolipásica. Desta forma, a peçonha foi fracionada em uma única etapa cromatográfica (C18 25mm X 4,6mm, 5 μm). Foram identificadas sete frações com massa molecular semelhante à fosfolipases A2 foram obtidas (14 a 18 kDa). A fração BiliTX-7 demonstrou atividade catalítica intensa sobre fosfolipídios (fosfatidilcolina e ácido fosfatídico) e a presença de várias isoformas foram identificadas por eletroforese bidimensional demonstrando possivelmente diferenças de glicosilação. Estudos de inibição de PLA2s e seu contexto fisiopatológico são necessários. Assim, as espécies B. atrox e M. lemniscatus foram utilizadas para a identificação do gene responsável pela produção de inibidores endógenos de fosfolipases A2 (PLIs). O material genético obtido do tecido hepático de cada uma das serpentes foram amplificados, clonados e sequenciado. Os genes de PLIs foram identificados para as duas espécies (At.PLI e MI.PLI ) e alguns parâmetros bioquímicos virtuais foram elucidados. Os dados obtidos servem como base para as proteínas que serão expressas futuramente em sistema de expressão recombinante como forma de continuação do trabalho para aplicação biotecnológica

Seleção e caracterização de Nanocorpos de Camelídeos contra o antígeno recombinante do segmento-S de Hantavírus, cepa Araucária

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação: Doutorado em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR) como requisito final para a obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Guerino StábeliAs hantaviroses são doenças emergentes de notificação compulsória transmitidas por roedores. Nas Américas são responsáveis por ocasionar a Síndrome Cardiopulmonar causada por Hantavírus (SCPH) com letalidade de até 50% nos casos confirmados. O diagnóstico precoce da infecção proporciona cuidados e atenção ao paciente reduzindo a elevada taxa de mortalidade e evolução da doença. Dada a importância do desenvolvimento de kits para diagnóstico mais sensíveis e específicos para a patologia, este estudo apresenta nanocorpos ou VHHs de camelídeos contra a proteína recombinante do nucleocapsídeo do hantavírus (rNΔ85) cepa Araucária, circulante no Brasil. Os nanocorpos apresentam características físico-químicas peculiares que os tornam excelentes protótipos para aplicações em diagnóstico e terapêutica, tais como tamanho reduzido, alta solubilidade, além de apresentarem uma notável resistência às variações de pH e ação proteolítica. Para o isolamento dos nanocorpos utilizou-se a tecnologia Phage Display. Assim, foram realizadas sucessivas imunizações de camelídeo Lama glama com a proteína rNΔ85 e a resposta imune monitorada por ELISA. A região codante do VHH foi isolada por RT-PCR a partir de linfócitos periféricos, utilizando oligonucleotídeos específicos. Uma biblioteca imune primária com título de 3x107clones foi construída utilizando o vetor fagomídeo pHEN1. Subsequentemente, os segmentos codantes dos VHHs foram fusionados ao gene da proteína III do capsídeo do fago filamentoso M13K07, constituindo uma biblioteca fágica com um título de 1,7x1011cfu/mL. Após duas rodadas de seleção foram selecionados 80 clones, dos quais 11 foram caracterizados por sequenciamento gênico. As sequências foram separadas em quatro grupos de acordo com a variabilidade apresentada nas regiões determinantes de complementaridade (CDR). Após testes prévios de interação por ressonância plasmônica de superfície (SPR) e imunodetecção por ELISA, o clone VHH KC329708, que demonstrou expressiva capacidade de reconhecimento à proteínar NΔ85, foi selecionado, subclonado em vetor fagomídeo pHEN-6xHistag e submetido a purificação por cromatografia de afinidade em coluna de Ni+2. Após purificação, a cinética de interação dos clones e a proteína recombinante foi determinada por SPR e a especificiade por western blotting, utilizando o anticorpo monoclonal anti-rNΔ85 como referência. Nos testes em sensorchip verificou-se que o VHH, clone KC329708, apresentou um KD=5,52x10-6(M) e cerca de 10RU, em comparação com o anticorpo monoclonal que apresentou um KD=3,38x10-6(M) e 3,5RU, indicando que o VHH KC329708 apresenta uma afinidade significativamente maior à rNΔ85 comparado ao anticorpo monclonal anti-rNΔ85 de murinos. Os resultados obtidos neste estudo suportam a ideia do uso deste VHH como insumo para diagnóstico de infecções por hantavírus devido à sua afinidade à rNΔ85. Adicionalmente, devido às características apresentadas pelos nanocorpos, especulamos o seu uso como intrabodies para rastreamento e inibição da proteína N do hantavírus durante a infecção e replicação viral

Amazonian biodiversity: a view of drug development for Leishmaniasis and malaria

Chemotherapy is the only validated therapy for the treatment for the neglected diseases leishmaniasis and malaria. However, the emergence of drug resistance, collateral effects and long-term treatment encourage the development of new and more efficient drugs. The Amazon tropical forest includes the richest areas of biodiversity in the world, including a great number of microbes, plant and animal species that produce a source of interesting biologically active molecules. Several of these molecules, obtained from plant extracts and frog venom have leishmanicidal and plasmodicidal activity, highlighting the potential of this biodiversity for the development of new drugs. In research, modern approaches in new drug development are carried out using combinatorial chemistry, high-throughput screening, bioinformatics, molecular interaction, crystallography and dynamic studies of cellular and systemic toxicity. In Brazil, these techniques are mainly present in only a few academic groups with no efficient connection to industry. The problem associated with over-regulation for accessing the biological material in restricted areas, local populations and indigenous areas places major barriers in the path of research and development of new drugs. Thus, the association of academic research groups in Brazil, encouraged and supported by government and industry, is essential to overcome these major barriers related to the development of new products for treatment of neglected diseases from Amazonian biodiversity in future years.A quimioterapia é o único procedimento farmacológico validado para a terapêutica da leishmaniose e da malária, consideradas doenças negligenciadas para o desenvolvimento de fármacos pelas indústrias farmacêuticas. Com a não renovação medicamentosa, o surgimento de resistência, os efeitos colaterais e o longo período de tratamento indicam a necessidade do desenvolvimento de novos e mais eficientes fármacos. A Floresta Amazônica é a região com a maior biodiversidade do planeta, com uma riqueza de animais e plantas produtoras de moléculas com atividades biológicas relevantes para o desenvolvimento e exploração biotecnológica. Algumas destas moléculas, obtidas de extratos vegetais e de venenos de anuros, apresentam atividade leishmanicida e plasmodicida, o que demonstra o potencial desta biodiversidade para a investigação de novas drogas. A moderna abordagem na pesquisa de novos fármacos envolve a associação de química combinatória, high-throughput screening, bioinformática, interação molecular, cristalografia e o estudo dinâmico de toxicidade sistêmica e celular, que atualmente no Brasil, estão distribuídas em poucos grupos acadêmicos sem a devida associação industrial. Esta deficiência, agregada ao excesso de regulamentação para o acesso ao material biológico, sobretudo, proveniente de unidades de conservação, populações tradicionais e nações indígenas, é um importante entrave para o desenvolvimento deste tipo de pesquisa. A associação de grupos de pesquisa do Brasil, estimulados por políticas governamentais de financiamento acadêmico e industrial, são essenciais para a superação destas dificuldades, de forma que nos próximos anos possam surgir novos produtos para terapia de doenças negligenciadas oriundas da biodiversidade amazônica

Engenharia de anticorpos na busca por fragmentos funcionais para insumos de diagnóstico e aplicações terapêuticas

Anticorpos, agentes empregados no desenvolvimento de pesquisas biomédicas, no diagnóstico e na terapêutica, possuem elevada capacidade de interação aos mais variados ligantes, Estruturalmente são heterotetrameros constituídos por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas com massa molecular de aproximadamente 150 kDa, Visando melhorar as características farmacocinéticas e minimizar possíveis reações adversas desencadeadas por imunoglobulinas de origem não humana, a engenharia molecular de anticorpos vem obtendo fragmentos de anticorpos como porções Fab, F(ab’)2, scFv e Fv, Em adição aos anticorpos convencionais, camelídeos produzem imunoglobulinas funcionais desprovidas de cadeia leve, onde o domínio variável da cadeia pesada, denominado VHH ou nanocorpo, é responsável pelo reconhecimento antigênico, Apresentando características adequadas ao desenvolvimento de fármacos com alta capacidade de neutralização, fragmentos VHHs vêm sendo propostos para uso em imunoterapia passiva ou em drug-delivery, No diagnóstico esses fragmentos podem ser aplicados na construção de biosensores ou na imagiologia, atuando na detecção de células cancerígenas, no monitoramento de tumores ou em alterações celulares

Amphibia, Anura, Microhylidae, Gastrophryninae, Elachistocleis Bicolor Guérin Méneville, 1838: Distribution Extension and Geographic Distribution Map

Submitted by EMERSON LEAL ([email protected]) on 2016-06-16T19:21:27Z No. of bitstreams: 1 Amphibia, Anura, Microhylidae.pdf: 744299 bytes, checksum: 1eef5c3bc97ec020366c0b6f152ab708 (MD5)Approved for entry into archive by EMERSON LEAL ([email protected]) on 2016-07-14T15:35:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Amphibia, Anura, Microhylidae.pdf: 744299 bytes, checksum: 1eef5c3bc97ec020366c0b6f152ab708 (MD5)Made available in DSpace on 2016-07-14T15:35:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amphibia, Anura, Microhylidae.pdf: 744299 bytes, checksum: 1eef5c3bc97ec020366c0b6f152ab708 (MD5) Previous issue date: 2013Made available in DSpace on 2016-07-15T18:40:35Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Amphibia, Anura, Microhylidae.pdf.txt: 18402 bytes, checksum: 078c76f293ad141482ec52d537ca1810 (MD5) Amphibia, Anura, Microhylidae.pdf: 744299 bytes, checksum: 1eef5c3bc97ec020366c0b6f152ab708 (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2013Universidade Federal de Rondônia. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas a Saúde. Núcleo de Saúde. Porto Velho, RO, Brazil.Universidade Federal do Acre. Centro Multidisciplinar. Laboratório de Geoprocessamento. Cruzeiro do Sul, AC, Brazil.Universidade Federal de Rondônia. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas a Saúde. Núcleo de Saúde. Porto Velho, RO, Brazil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Zoologia. Setor de Ciências Biológicas. Curitiba, PR, Brazil.Fundação Oswaldo Cruz. Porto Velho, RO, Brazil. / Universidade Federal de Rondônia. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas a Saúde. Núcleo de Saúde. Porto Velho, RO, Brazil.Fundação Oswaldo Cruz. Porto Velho, RO, Brazil. / Universidade Federal de Rondônia. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas a Saúde. Núcleo de Saúde. Porto Velho, RO, Brazil.Fundação Oswaldo Cruz. Porto Velho, RO, Brazil. / Universidade Federal de Rondônia. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas a Saúde. Núcleo de Saúde. Porto Velho, RO, Brazil.Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais de Rondônia. Porto Velho, RO, Brazil. / Universidade Federal de Rondônia. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas a Saúde. Núcleo de Saúde. Porto Velho, RO, Brazil.The geographic distribution of Elachistocleis bicolor (Anura: Microhylidae) extends over several biomes in Argentina, Bolivia, Paraguay, Peru, Uruguay and Brazil. In Brazil, this species was reported to occur in the States of Amazonas, Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso do Sul, Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina and São Paulo. The current study reports the first record of E. bicolor for the state of Rondônia, Brazil, extending its distribution in 350 km eastwards from closest records in Beni, Bolivia and 715 km southwestwards from closest records in Amazonas

Effect of BjcuL, a lectin isolated from Bothrops jararacussu, on human peripheral blood mononuclear cells

Submitted by EMERSON LEAL ([email protected]) on 2019-05-17T15:05:57Z No. of bitstreams: 1 Effect of BjcuL, a lectin isolated from Bothrops jararacussu, on human peripheral blood mononuclear cells.pdf: 1969117 bytes, checksum: 83d69880c202052f691a3820748335b6 (MD5)Approved for entry into archive by EMERSON LEAL ([email protected]) on 2019-05-17T20:51:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Effect of BjcuL, a lectin isolated from Bothrops jararacussu, on human peripheral blood mononuclear cells.pdf: 1969117 bytes, checksum: 83d69880c202052f691a3820748335b6 (MD5)Made available in DSpace on 2019-05-17T20:51:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Effect of BjcuL, a lectin isolated from Bothrops jararacussu, on human peripheral blood mononuclear cells.pdf: 1969117 bytes, checksum: 83d69880c202052f691a3820748335b6 (MD5) Previous issue date: 2017Fundação Oswaldo Cruz. Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à Saúde. Porto Velho, RO, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à Saúde. Porto Velho, RO, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à Saúde. Porto Velho, RO, Brasil. / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Universidade Federal de Rondônia. Departamento de Medicina. Porto Velho, RO, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à Saúde. Porto Velho, RO, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à Saúde. Porto Velho, RO, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à Saúde. Porto Velho, RO, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à Saúde. Porto Velho, RO, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Laboratório de Engenharia de Anticorpos. Porto Velho, RO, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Universidade Federal de Rondônia. Departamento de Medicina. Porto Velho, RO, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Laboratório de Engenharia de Anticorpos. Porto Velho, RO, Brasil. / Centro de Pesquisa em Medicina Tropical. Porto Velho, RO, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Universidade Federal de Rondônia. Departamento de Medicina. Porto Velho, RO, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à Saúde. Porto Velho, RO, Brasil. / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Universidade Federal de Rondônia. Departamento de Medicina. Porto Velho, RO, Brasil.BjcuL is a C-type lectin with specificity for the binding of β-D-galactose units isolated from Bothrops jararacussu venom. It triggers cellular infiltration in post capillary venules, increases edema and vascular permeability inmurine models, contributes to in vitro neutrophil activation and modulates macrophage functional activation towards an M1 state. The purpose of this study was to investigate the effect of BjcuL on human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) activation with a focus on PBMCs proliferation and inflammatory mediators release. Results showed that BjcuL is not toxic to PBMCs, that BjcuL inhibits PBMCs proliferation and that it stimulates PBMCs to produce superoxide anion and hydrogen peroxide, primarily via lymphocyte stimulation, but does not stimulate the production of nitric oxide and PGE2. These results demonstrate that BjcuL has an immunomodulatory effect on PBMCs. Further studies are needed to confirm the immunomodulatory effect of BjcuL, to elucidate the molecular mechanisms of action responsible for its effects and to determine its potential application as an immunopharmacological and biotechnological tool