Subcellular distribution of the V-ATPase complex in plant cells, and in vivo localisation of the 100 kDa subunit VHA-a within the complex

BACKGROUND: Vacuolar H(+)-ATPases are large protein complexes of more than 700 kDa that acidify endomembrane compartments and are part of the secretory system of eukaryotic cells. They are built from 14 different (VHA)-subunits. The paper addresses the question of sub-cellular localisation and subunit composition of plant V-ATPase in vivo and in vitro mainly by using colocalization and fluorescence resonance energy transfer techniques (FRET). Focus is placed on the examination and function of the 95 kDa membrane spanning subunit VHA-a. Showing similarities to the already described Vph1 and Stv1 vacuolar ATPase subunits from yeast, VHA-a revealed a bipartite structure with (i) a less conserved cytoplasmically orientated N-terminus and (ii) a membrane-spanning C-terminus with a higher extent of conservation including all amino acids shown to be essential for proton translocation in the yeast. On the basis of sequence data VHA-a appears to be an essential structural and functional element of V-ATPase, although previously a sole function in assembly has been proposed. RESULTS: To elucidate the presence and function of VHA-a in the plant complex, three approaches were undertaken: (i) co-immunoprecipitation with antibodies directed to epitopes in the N- and C-terminal part of VHA-a, respectively, (ii) immunocytochemistry approach including co-localisation studies with known plant endomembrane markers, and (iii) in vivo-FRET between subunits fused to variants of green fluorescence protein (CFP, YFP) in transfected cells. CONCLUSIONS: All three sets of results show that V-ATPase contains VHA-a protein that interacts in a specific manner with other subunits. The genomes of plants encode three genes of the 95 kDa subunit (VHA-a) of the vacuolar type H(+)-ATPase. Immuno-localisation of VHA-a shows that the recognized subunit is exclusively located on the endoplasmic reticulum. This result is in agreement with the hypothesis that the different isoforms of VHA-a may localize on distinct endomembrane compartments, as it was shown for its yeast counterpart Vph1

Aufdeckung der räumlichen Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und alternierender Laseranregung

Roß J. Aufdeckung der räumlichen Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und alternierender Laseranregung. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2006.Die in dieser Arbeit vorgestellte Methode der dreifach alternierenden Laseranregung (TrALEx) stellt eine Erweiterung der Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie dar. Der Einsatz mehrerer Anregungswellenlängen erlaubt es, unterschiedlich fluoreszierende Sonden simultan zur Erforschung der Zusammensetzung oder räumlichen Wechselwirkungsmöglichkeiten im Rahmen von FRET z.B. an Biomolekülen einzusetzen. Mit der entwickelten Methode lassen sich: - Räumliche Anordnungen innerhalb einzelner Moleküle / Molekülkomplexe abfragen. - Bindungen an komplexen Molekülen / Molekülaggregaten studieren. - Zeitliche Strukturveränderungen molekularer Aggregate nachweisen. - Subpopulationen in einer heterogenen Probe selektiv auswerten. - Konkurrierende Energietransferpfade auflösen. - Lecks z.B in einem gerichteten FRET über mehrere Stationen aufdecken. - Abstände jenseits des zweifarbigen FRET bestimmen. Die alternierende Laseranregung wurde mit einem akusto-optischen Filter (AOTF) bewerkstelligt, der aus den Linien eines Multiline-Lasers die jeweilige Wellenlänge selektiert. Die für die Charakterisierung notwendigen Proben für gerichteten Energietransfer und Energietransfer mit drei beliebigen Transferpfaden wurden sowohl mit klassischer Ensemblespektroskopie als auch mit der auf TrALEx erweiterten Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie untersucht. Ein Vergleich der Daten mit herkömmlicher Einzelmolekülmikroskopie, mit nur einer anregenden Wellenlänge, deckte wesentliche Informationen über die Transferpfade des FRET bei beiden Proben auf. Es konnten Abstände zwischen mehreren Farbstoffen bestimmt werden, selbst wenn die Energietransferpfade konkurrieren. Aufgrund der zusätzlichen Anregungswellenlängen wurden für einige Farbstoffe Indizien für weiter zu untersuchende photophysikalische Effekte gefunden. Den zweiten Schwerpunkt dieser Dissertation bildet die partielle Strukturauflösung des heterogenen Proteinkomplexes der vakuolären H+ -ATPase. Dieser Komplex aus zwölf unterschiedlichen Proteinen wurde mit Methoden aus der Ensemblespektroskopie und der Einzelmolekülspektroskopie untersucht. Bindungsstudien auf Einzelmolekülebene des chaotropen Salzen ausgesetzten Proteinkomplexes konnten eindrucksvoll belegen, dass sich dieser nach Dialyse teilweise reassembliert. Es wurde der Nachweis erbracht, dass statistisches Markieren von Molekülkomplexen einen Zugang zur Struktur und Zusammensetzung von Biomolekülen bilden kann. Mit dieser Methode konnte die Integration der heterolog exprimierten Untereinheit E in den solubilisierten Gesamtkomplex nachgewiesen werden. Ebenso wurde die Annahme einer Dimerisierung der Untereinheit E und ihr zweifaches Vorkommen im Gesamtkomplex in vitro in Frage gestellt

SINUS.NRW: Mathematik ohne Hilfsmittel

In vielen Studiengängen werden solide Grundkenntnisse der Mathematik vorausgesetzt. Hier kommt es insbesondere auch auf Kompetenzen an, die bereits am Ende der Sekundarstufe I erworben sein sollten. In diesem Band sind Aufgaben zusammengestellt, die Schülerinnen und Schüler ohne Nutzung von digitalen Hilfsmitteln am Ende der Sekundarstufe I bearbeiten können sollen. Die Initiative zur Herausgabe dieser Aufgabensammlung ging von einer Arbeitsgruppe aus Vertretern von Hochschulen, den Ministerien für Schule und Bildung (MSB) und für Kultur und Wissenschaft (MKW) sowie der Qualitäts- und UnterstützungsAgentur – Landesinstitut für Schule (QUA-LiS) aus

Anteilvorstellung als Grundlage der Bruchrechnung

Veit A, Jarczak K, Klocov K, et al. Anteilvorstellung als Grundlage der Bruchrechnung. In: Roß J, Qualität- und UnterstützungsAgentur - Landesinstitut für Schule des Landes Nordrhein Westfalen, eds. SINUS.NRW: Motivation durch kognitive Aktivierung. Impulse zur Weiterentwicklung des Unterrichts in den MINT-Fächern. Beiträge zur Schulentwicklung | PRAXIS . Bielefeld: wbv Media; 2020: 15-33