Proteómica dirigida aplicada a la búsqueda de biomarcadores en sueros de pacientes con artritis reumatoide

[Resumen] La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la inflamación de las articulaciones y por la presencia de factor reumático (RF) y antiproteínas citrulinadas (ACPA) en la sangre. La heterogeneidad de los pacientes y la ausencia de pruebas clínicas suficientemente precisas y sensibles para identificar las primeras etapas de la enfermedad impiden su diagnóstico temprano. Por ello, es de gran interés la búsqueda, identificación y verificación de biomarcadores específicos para el diagnóstico y los estudios de progresión en AR. El objetivo de este estudio es la aplicación de una estrategia proteómica dirigida basada en la técnica MRM (multi reaction monitoring) para detectar, cuantificar y verificar un panel de biomarcadores asociados con AR en sueros de pacientes individuales. El panel ha sido previamente identificado por el grupo de proteómica del INIBIC mediante técnicas de proteómica al azar. Para este estudio, 80 muestras de suero fueron clasificadas en función de la presencia/ausencia de RF y ACPA de la siguiente manera: 20 muestras RF+/ACPA+, 20 muestras RF+/ACPA-, 20 muestras RF-/ACPA+ y 20 muestras RF-/ACPA. El análisis cuantitativo entre las distintas condiciones de estudio se llevó a cabo usando unos péptidos marcados isotópicamente en sus aminoácidos, como estándares internos. Para el desarrollo del método MRM y el análisis de datos se utilizó el programa Skyline. Se identificaron y cuantificaron 26 péptidos pertenecientes a 10 proteínas en un único análisis. El análisis estadístico mediante el Test de Mann-Whitney mostró una modulación significativa (p < 0.05) para 8 proteínas: 4 proteínas en RF+/ACPA+, 5 proteínas en RF+/ACPA- y 6 proteínas en RF-/ACPA+ en comparación con RF-/ACPA-. Los resultados sugieren que estas proteínas están relacionadas con la AR. Actualmente, están en curso experimentos para la validación en otra cohorte de sueros, con un mayor número de pacientes para su posterior uso como biomarcadores de AR.[Resumo] A artritis reumatoide é unha enfermidade autoinmune caracterizada póla inflamación das articulacións e pola presencia de factor reumático (RF) e antiproteínas citrulinadas (ACPA) no sangue. A heteroxeneidade dos pacientes e a ausencia de probas clínicas suficientemente precisas e sensibles para identifica-las primeiras etapas da enfermidade impiden o seu diagnóstico precoz. Por elo, é de grande interese a busca, identificación e verificación de biomarcadores específicos para o diagnóstico e os estudos de progresión en AR. O obxectivo deste estudo é a aplicación dunha estratexia proteómica dirixida baseada na técnica MRM (multi reaction monitoring) para detectar, cuantificar e verificar un panel de biomarcadores asociados ca AR en soros de pacientes individuais. O panel foi previamente identificado polo grupo de proteómica do INIBIC mediante técnicas de proteómica ó azar. Para este estudo, 80 mostras de soro foron clasificadas en función da presenza/ausencia de RF y ACPA da seguinte maneira: 20 mostras RF+/ACPA+, 20 mostras RF+/ACPA-, 20 mostras RF-/ACPA+ y 20 mostras RF-/ACPA-. O análise cuantitativo entres as diferentes condicións de estudo levouse a cabo usando uns péptidos marcados isotópicamente nos seus aminoácidos, como estándares internos. Para o desenvolvemento do método MRM e o análise de datos utilizouse o programa Skyline. Identificáronse e cuantificáronse 26 péptidos pertencentes a 10 proteínas nun único análise. O análise estatístico mediante o Test de Mann-Whitney amosou unha modulación significativa (p < 0.05) para 8 proteínas: 4 proteínas en RF+/ACPA+, 5 proteínas en RF+/ACPA- y 6 proteínas en RF-/ACPA+ en comparación con RF-/ACPA-. Os resultados suxiren que estas proteínas están relacionadas ca AR. Actualmente, están en curso experimentos para a validación noutra cohorte de soros, con un maior número de pacientes para o seu posterior uso como biomarcadores de AR.[Abstract] Rheumatoid Arthritis (RA) is an autoimmune disease characterized by inflammation of the joints and by the presence of anti-citrullinated protein antibodies (ACPA) and Rheumatoid Factor (RF) in blood. The heterogeneity of patients and the lack of clinical tests accurate enough to identify the early stages of disease have hampered its early diagnosis. Therefore, the search, identification and verification of specific biomarkers for diagnosis and progression studies in AR are of great interest. The aim of this study was the application of a targeted proteomic approach based on MRM technic (multi reaction monitoring) to detect, quantify and verify a panel of biomarkers associated with AR in individual serum samples. The panel has been previously identified by the INIBIC proteomics group through shotgun proteomics. For this study, 80 serum samples were classified according to their absence/presence of RF and ACPA as follows: 20 samples RF+/ACPA+, 20 samples RF+/ACPA-, 20 samples RF-/ACPA+, 20 samples RF-/ACPA-. The quantitative analysis between the different study conditions was carried out using peptides marked isotopically in their amino acids, as internal standards. Skyline program was used for the development of the MRM method and data analysis. 26 peptides belonging to 10 proteins have been identified and quantified in a single analysis. Statistical analysis using the Mann-Whitney test showed a significant modulation (p <0.05) for 8 proteins: 4 proteins in RF + / ACPA +, 5 proteins in RF + / ACPA- and 6 proteins in RF- / ACPA + compared to RF- / ACPA-. The results suggest that these proteins are related with the RA, and further experiments are now in course to validate these results in another sera cohort, with a bigger number of patients for its later use as AR biomarkers.Traballo fin de mestrado (UDC.FCS). Asistencia e investigación sanitaria. Especialidade en Fundamentos de la investigación biomédica. Curso 2017/2018

Anatomy and Connectivity of the Torus Longitudinalis of the Adult Zebrafish

[Abstract] This study describes the cytoarchitecture of the torus longitudinalis (TL) in adult zebrafish by using light and electron microscopy, as well as its main connections as revealed by DiI tract tracing. In addition, by using high resolution confocal imaging followed by digital tracing, we describe the morphology of tectal pyramidal cells (type I cells) that are GFP positive in the transgenic line Tg(1.4dlx5a-dlx6a:GFP)ot1. The TL consists of numerous small and medium-sized neurons located in a longitudinal eminence attached to the medial optic tectum. A small proportion of these neurons are GABAergic. The neuropil shows three types of synaptic terminals and numerous dendrites. Tracing experiments revealed that the main efference of the TL is formed of parallel-like fibers that course within the marginal layer of the optic tectum. A toral projection to the thalamic nucleus rostrolateralis is also observed. Afferents to the TL come from visual and cerebellum-related nuclei in the pretectum, namely the central, intercalated and the paracommissural pretectal nuclei, as well as from the subvalvular nucleus in the isthmus. Additional afferents to the TL may come from the cerebellum but their origins could not be confirmed. The tectal afferent projection to the TL originates from cells similar to the type X cells described in other cyprinids. Tectal pyramidal neurons show round or piriform cell bodies, with spiny apical dendritic trees in the marginal layer. This anatomical study provides a basis for future functional and developmental studies focused on this cerebellum-like circuit in zebrafish.IB was supported by a Sir Henry Dale Fellowship from the Royal Society and Wellcome Trust (101195/Z/13/Z) and a UCL Excellence Fellowship. This project was also funded by University of A CoruñaReino Unido. Royal Society; 101195/Z/13/