EGYEDI SEJTEK ADHÉZIÓS VIZSGÁLATA SZÁMÍTÓGÉP-VEZÉRELT MIKROPIPETTÁVAL

Az egyedi sejtek válogatása és manipulálása komoly kihívást jelent az ép sejteket igényelő vizsgálatokban, mint pl. a DNS vagy RNS szekvenálás esetén. A számítógép-vezérelt mikropipetta rendszer [1] azonban lehetővé teszi, hogy az előzetesen szoftveresen vagy manuálisan detektált, Petri csészében lévő sejteket egyenként tudjuk manipulálni és válogatni. Kísérleteinkhez neuroektodermális egér progenitor, és human vérből izolált monocita sejteket használtunk [2]. 15-20 mp/sejt válogatási sebességgel 0,4–0,7 μl térfogatú, egyedi sejteket tartalmazó cseppeket tudtunk automatikusan izolálni PCR csövekben. A mikroliter alatti mérettartomány elérése fontos paraméter a további vizsgálatok szempontjából, ugyanis ezek költséges reagenseket igényelnek. A sejtadhézió alapvető jelenség a többsejtű élőlények számára. Azonban az egyedi sejtek direkt adhéziós erejének meghatározására alkalmas technikák (pl. AFM) rendkívül alacsony áteresztőképességűek, kísérletenként ~10 sejt mérhető le velük. A számítógép-vezérelt mikropipettával egyedi humán fehérvérsejtek és specifikus makromolekulák kölcsönhatását tanulmányoztuk [3]. A leukociták adhéziója a specifikus makromolekulákhoz fontos feladat az immunválasz elindításában. Azt tapasztaltuk, hogy a primer monociták kevésbé adherensek a fibrinogén felületen, mint az in vitro differenciáltatott származékai: a makrofágok és dendritikus sejtek, az utóbbiak mutatták a legmagasabb adhéziós erőt. Az eredményeket mikrofluidikai áramlási csatornával is alátámasztottuk. Ezzel a módszerrel több száz sejt vizsgálható egyenként, viszonylag rövid idő alatt (~30 perc)

Functional differences between human CR3 (CD11b/CD18) and CR4 (CD11c/CD18): CD11b dominates iC3b mediated phagocytosis, while CD11c prevails adherence

Complement receptors CR3 (CD11b/CD18) and CR4 (CD11c/CD18) belong to the family of beta2 integrins and are expressed by several, mainly myeloid cell types in humans. Their function is to mediate iC3b opsonized phagocytosis and adherence to ICAM-1 and fibrinogen. These functions were so far analysed under experimental conditions, where the contribution of CD11b/CD18 and CD11c/CD18 could not be separated. Although very little is known about the features of CR4, it is supposed that the two integrins exert similar functions, since they bind the same ligands. From an evolutionary aspect however it does not seem rewarding to maintain two receptors with similar ligand specificity for the same functions. Therefore our goal is to reveal what separate functions might be exerted by CR3 and CR4 We used both classical and high throughput label free optical biosensor and single cell analysis methods to decipher the distinct role of CD11c. Previously we demonstrated that on human monocyte-derived dendritic cells (MDCs) CD11b is responsible for iC3b mediated phagocytosis, while CD11c is dispensable. In our recent work we analysed how CD11b and CD11c participate in adherence to their ligands. We employed human monocytes, monocyte-derived macrophages (MDMs) and MDCs which highly express CR3 and CR4 and adherence is their natural property. First we determined the exact number of CD11b and CD11c on these cell types by a bead based technique, and found that the ratio of CD11b/CD11c is 1.2 for MDCs, 1.7 for MDMs and 7.1 for monocytes, suggesting that CD11c is most important for MDCs and less for monocytes. By analyzing the kinetics and force of adherence of the different cell types to immobilized fibrinogen ligand, we found that attachment of MDCs is stronger than that of monocytes. Using antibody blocking and RNA silencing techniques we proved that adherence to fibrinogen – the common ligand of CR3 and CR4 – is mediated by CD11c. When we previously analyzed iC3b mediated phagocytosis, we found that blocking CD11c does not impair this function. In contrast to this, in the case of adherence, we found that blocking CD11b even enhances attachment to fibrinogen, suggesting a competition between CD11b and CD11c for this ligand

Egyedi sejtek adhéziós vizsgálata számítógép- vezérelt mikropipettával

A leukociták adhéziója a specifikus makromolekulákhoz fontos feladat az immunválasz elindításában. Azonban az egyedi sejtek direkt adhéziós erejének meghatározása még napjainkban is kihívást jelent, hiszen az erre alkalmas technikák rendkívül alacsony áteresztőképességűek (5-10 sejt/nap). Egy inverz mikroszkópra felszerelt számítógép- vezérelt mikropipetta technikával egyedi humán fehérvérsejtek és specifikus makromolekulák kölcsönhatását tanulmányoztuk. A felülethez tapadt sejtek adhéziós ereje pontosan meghatározható a sejtválogatási folyamat ismétlésével, egyre növekvő vákuumot alkalmazva a sejt felett elhelyezkedő mikropipettában. Ezzel a módszerrel több száz sejt vizsgálható egyenként, viszonylag rövid idő alatt (~30 perc). Kísérleteink során a nem specifikus sejtadhéziót PLL-g-PEG polimerrel blokkoltuk. Azt tapasztaltuk, hogy a primer monociták kevésbé adherensek a fibrinogén felületen, mint az in vitro differenciáltatott származékai: a makrofágok és dendritikus sejtek, az utóbbiak mutatták a legmagasabb adhéziós erőt. Megvizsgáltuk a CD11b/CD18 (αMβ2) és CD11c/CD18 (αXβ2) integrinek hozzájárulását a fent említett 3 sejttípus adhéziójára. A CD11b/CD18 integrin meglepő gátló hatását észleltük a sejtadhézión

Automated single cell isolation from suspension with computer vision

Current robots can manipulate only surface-attached cells seriously limiting the fields of their application for single cell handling. We developed a computer vision-based robot applying a motorized microscope and micropipette to recognize and gently isolate intact individual cells for subsequent analysis, e.g., DNA/RNA sequencing in 1–2 nanoliters from a thin (~100 μm) layer of cell suspension. It can retrieve rare cells, needs minimal sample preparation, and can be applied for virtually any tissue cell type. Combination of 1 μm positioning precision, adaptive cell targeting and below 1 nl liquid handling precision resulted in an unprecedented accuracy and efficiency in robotic single cell isolation. Single cells were injected either into the wells of a miniature plate with a sorting speed of 3 cells/min or into standard PCR tubes with 2 cells/min. We could isolate labeled cells also from dense cultures containing ~1,000 times more unlabeled cells by the successive application of the sorting process. We compared the efficiency of our method to that of single cell entrapment in microwells and subsequent sorting with the automated micropipette: the recovery rate of single cells was greatly improved

Detection of red blood cell surface antigens by probe-triggered cell collision and flow retardation in an autonomous microfluidic system

AbstractMicrofluidic devices exploit combined physical, chemical and biological phenomena that could be unique in the sub-millimeter dimensions. The current goal of development of Point-of-Care (POC) medical devices is to extract the biomedical information from the blood. We examined the characteristics of blood flow in autonomous microfluidic devices with the aim to realize sensitive detection of interactions between particulate elements of the blood and the appropriately modified surfaces of the system. As a model experiment we demonstrated the fast analysis of the AB0 blood group system. We observed that the accumulation of red blood cells immobilized on the capillary wall leads to increased lateral movement of the flowing cells, resulting in the overall selective deceleration of the red blood cell flow column compared to the plasma fraction. We showed that by monitoring the flow rate characteristics in capillaries coated with blood type reagents it is possible to identify red blood cell types. Analysis of hydrodynamic effects governing blood flow by Finite Element Method based modelling supported our observations. Our proof-of-concept results point to a novel direction in blood analysis in autonomous microfluidic systems and also provide the basis for the construction of a simple quantitative device for blood group determination.</jats:p