Equine influenza in Brazil

Equine influenza virus (EIV) (H3N8 and H7N7) is the causative agent of equine influenza, or equine flu. The H7N7 subtype has been considered to be extinct worldwide since 1980. Affected animals have respiratory symptoms that can be worsened by secondary bacterial respiratory infection, thereby leading to great economic losses in the horse-breeding industry. In Brazil, equine influenza outbreaks were first reported in 1963 and studies on hemagglutination antibodies against viral subtypes in Brazilian horses have been conducted since then. The objective of the present review was to present the history of the emergence of EIV around the world and in Brazil and the studies that have thus far been developed on EIV in Brazilian equines.O vírus da influenza equina (EIV) (H3N8 e H7N7) é o agente causador da influenza equina, ou gripe equina. O subtipo viral H7N7 é considerado como mundialmente extinto desde 1980. Os animais afetados têm sintomas respiratórios característicos que podem ser agravados por uma infecção respiratória bacteriana secundária causando grandes prejuízos no ramo equestre. No Brasil, os surtos da EI têm sido relatados desde 1963 e desde então vem sendo efetuados estudos sobre a presença de anticorpos hemaglutinantes contra os subtipos virais nos equídeos brasileiros. O presente artigo tem o objetivo de apresentar um histórico sobre o surgimento do EIV no mundo e no Brasil destacando os estudos conduzidos no Brasil até o momento acerca da infecção pelo EIV nos equídeos brasileiros

Sobre a evolução do vírus da bronquite infecciosa das galinhas em células VERO

Avian infectious bronchitis virus (IBV) (Nidovirales: Coronaviridae) is a chicken Gammacoronavirus with the highestevolution rate in the genus and, despite the recently reported proofreading activity of its polymerase, intra and interhost diversity is a well-documented phenomenon. This study aimed to assess the genetic variation of serial passages of a variant genotype IBV strain in vitro. Strain CRG-BETA, propagated in chicken embryos, was inoculated in VERO cells monolayers up to the 4th passage and each passage was monitored with an RT-PCR targeted to the S1 gene (nt 705to 1094) and an RT-PCR to the protein 5a mRNA. All passages were positive to RT-PCRs to S1 and passages 1 to 3 to5a mRNA; S1 sequences showed no polymorphism. The finding of IBV mRNA in the cell cultures demonstrates that the CRG-BETA IBV strain is replicating in the VERO cells and regarding S1 sequence analysis, the lack of nucleotide mutations shows that CRG-BETA might have reached a fixed status. As a conclusion, different genotypes of IBV present different evolutionary patterns not only in vivo as previously known, but also in vitro, as described herein.O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) (Nidovirales: Coronaviridae) é um Gammacoronavirus com a maior taxa evolutiva no gênero e, apesar de uma recentemente relatada atividade corretiva de sua polimerase, a diversidade intra e inter-hospedeiros é um fenômeno bem documentado. Este estudo objetivou avaliar a variação genética após passagens seriais de uma amostra de IBV variante. A amostra CRG-BETA, propagada em embriões de galinhas, foi inoculada em monocamadas de células VERO até a quarta passagem e cada passagem foi monitorada com uma RTPCR para a região S1 do gene S (nt 705 a 1094) e uma RT-PCR para o mRNA da proteína 5a do vírus. Todas as passagens foram positivas para S1 e as passagens 1 a 3 para mRNA 5a; sequências de S1 não apresentaram polimorfismos. O encontro de mRNA de IBV nos cultivos celulares demonstra que a amostra CRG-BETA está replicando nas células VERO e, em relação à análise de S1, a ausência de mutações de nucleotídeos demonstra que a amostra CRG-BETA pode ter atingido um estado fixo. Como conclusão, diferentes genótipos de IBV apresentam diferentes padrões evolutivos não apenas in vivo, como previamente conhecido, mas também in vitro, como aqui relatado

Extensively variable surface antigens of Sarcocystis spp. infecting Brazilian marsupials in the genus Didelphis occur in myriad allelic combinations, suggesting sexual recombination has aided their diversification

AbstractSarcocystis neurona and Sarcocystis falcatula are very similar species of Apicomplexan protozoa that use marsupials of the genus Didelphis as definitive hosts. These mammals can serve as definitive hosts not only for these two parasites, but for other Sarcocystis such as Sarcocystis speeri and Sarcocystis lindsayi. Sarcocystis shed by opossums (with the exception of S. neurona) can cause disease in a great variety of birds, being commonly associated with acute pulmonary sarcocystosis in zoos. S. neurona is the most commonly associated parasite with the equine protozoal myeloencephalitis in horses. Herein we assessed the variability of Sarcocystis spp. isolated from opossums of the state of Rio Grande do Sul, Brazil, by sequencing fragments of genes coding for glycosylphosphatidylinositol-anchored surface antigens (termed surface antigen or SAG), SAG2, SAG3 and SAG4. Two genetic groups were identified, one of them related to S. falcatula and the other related to S. neurona. Various allelic combinations of SAG2, SAG3 and SAG4 occur among S. falcatula related isolates and strong evidences suggest that such isolates may exchange high divergent alleles in possible sexual recombination processes. Regarding the group S. neurona-like (isolates G37 and G38), none of the individuals in this group share alleles with individuals of the other group. Comparing G37 and G38 strains and North American strains of S. neurona, four polymorphisms were identified at SAG-3, five at SAG-2 and three at SAG-4. Gene sequences of locus SAG-3 from isolates G37 and G38 differed from the other sequences by an insertion 81bp long. This insertion contains several dinucleotide repeats of AT, resembling a microsatellite locus and has already been detected in SAG3 sequences of S. neurona from North America. When aligned against North American strains of S. neurona, G37 and G38 isolates have a deletion of 8 nucleotides within this intron which indicate that S. neurona strains of South America are divergent from that of North America. From the results obtained so far, we have shown extensive variability in surface antigens coding sequences among Sarcocystis eliminated by mammals of the genus Didelphis spp. In addition, such divergent alleles may be exchanged in possible sexual recombination processes between different isolates of S. falcatula related isolate. The evolutionary relationships within S. falcatula related isolates will be best clarified after markers less subjected to selection pressures are analyzed in conjunction with surface antigen genes. These results may have a striking impact on the knowledge of the Sarcocystis species that infect opossums in Brazil and also in the epidemiology of the infections caused by these protozoans

Agrupamento genético de isolados do vírus da bronquite infecciosa das aves no Brasil com base na análise do gene S1 por RT-PCR-RFLP

Doze isolados de campo do Brasil e uma estirpe de referência vacinal do vírus da bronquite infecciosa das aves (VBI) foram propagadas em ovos embrionados SPF. O gene S1 dessas amostras foi analisado por RT-PCR seguido de RFLP, empregando-se as enzimas de restrição HaeIII, XcmI e BstyI. Observou-se a existência de cinco genótipos diferentes: M (Massachusetts), A , B, C e D. Cinco dos doze isolados de campo do VBI foram classificados no genótipo Massachusetts e os sete vírus restantes foram classificados em quatro genotipos diferentes; A (2), B (2), C (2) ou D (1). Os resultados desta genotipagem concordam com os dados obtidos na análise imunológica previamente realizada para a maior parte destes vírus, destacando a ocorrência de uma variabilidade marcante entre os isolados do VBI que estão circulando nas granjas avícolas comerciais do BrasilTwelve Brazilian isolates and one reference vaccine strain of avian infectious bronchitis virus (IBV) were propagated in embryonating chicken eggs. The entire S1 glycoprotein gene of these viruses was analysed by reverse-transcriptase-polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (RT-PCR-RFLP), using the restriction enzymes HaeIII, XcmI and BstyI. The RFLP patterns led to the classification of these isolates into five distinct genotypes: A, B, C, D and Massachusetts. Five of twelve isolates were grouped in Massachusetts genotype and the remaining seven viruses were classified into four distinct genotypes: A (2), B (2), C (2) or D (1). Such genotyping classification agreed with previous immunological analysis for most of these viruses, highlighting the occurrence of a relevant variability among the IBV strains that are circulating in Brazilian commercial poultry flock

Estudo da patogenia do vírus da raiva por meio de amostras ERA e PV administradas por via oral em hamsters (M. auratus)

Hamsters orally inoculated with ERA and PV strains of rabies virus were sacrificed at 24, 48, 72 hours, 21 and 30 days after inoculation. Brain fragments were examined by Fluorescent Antibody test (FAT) and heminested PCR (hn-PCR). Fragments from stomach, blood, heart, and lung were examined only by hn-PCR. Sera of other hamsters, similarly inoculated, obtained at 30th day after inoculation were submitted to mouse neutralization test. The hamsters were challenged intracerebrally with CVS strain with 10(2.7)mouse LD50/0.03mL, 45 days after inoculation. Brains examined by FAT were negative. The hn-PCR detected the presence of rabies virus RNA in the lung of one animal inoculated with ERA, and in the brain, stomach, blood, and lung of PV-infected animals. The orally inoculated virus was capable to infect and replicate in several organs and tissues; however, none of the challenged hamsters did survive after challenge.Hamsters inoculados oralmente com as amostras de vírus rábico ERA e PV foram sacrificados após 24, 48 e 72 horas, 21 e 30 dias. Fragmentos do cérebro foram analisados através da imunofluorescência direta (IFD) e heminested-PCR (hn-PCR). Os fragmentos do estômado, sangue, coração e pulmão foram examinados somente com a técnica de hn-PCR. Soros de outros hamsters, inoculados de modo similar e obtidos 30 dias após a inoculação, foram submetidos ao teste de soroneutralização (SNT) em camundongos. No 45º dia pós-inoculação, os hamsters foram desafiados intracerebralmente com a amostra CVS, contendo 10(2,7)DL50 em camundongos/0,03 mL. Os fragmentos do cérebro foram todos negativos ao teste de imunofluorescência. A hn-PCR detectou a presença de RNA do vírus da raiva no pulmão de um animal inoculado com a amostra ERA e, no cérebro, estômago, sangue e pulmão de hamsters inoculados com a amostra PV. As amostras de vírus inoculadas oralmente foram capazes de se replicar em diferentes órgãos, no entanto, todos od hamsters morreram ao desafio, indicando uma resposta imunológica insuficiente

Detecção rápida do Coronavírus Bovino (BCoV) por meio de uma semi-nested RT-PCR

Bovine coronavirus (BCoV) is a member of the group 2 of the Coronavirus (Nidovirales: Coronaviridae) and the causative agent of enteritis in both calves and adult bovine, as well as respiratory disease in calves. The present study aimed to develop a semi-nested RT-PCR for the detection of BCoV based on representative up-to-date sequences of the nucleocapsid gene, a conserved region of coronavirus genome. Three primers were designed, the first round with a 463bp and the second (semi-nested) with a 306bp predicted fragment. The analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titre: 256) in DEPC treated ultra-pure water, in fetal bovine serum (FBS) and in a BCoV-free fecal suspension, when positive results were found up to the 10-2, 10-3 and 10-7 dilutions, respectively, which suggests that the total amount of RNA in the sample influence the precipitation of pellets by the method of extraction used. When fecal samples was used, a large quantity of total RNA serves as carrier of BCoV RNA, demonstrating a high analytical sensitivity and lack of possible substances inhibiting the PCR. The final semi-nested RT-PCR protocol was applied to 25 fecal samples from adult cows, previously tested by a nested RT-PCR RdRp used as a reference test, resulting in 20 and 17 positives for the first and second tests, respectively, and a substantial agreement was found by kappa statistics (0.694). The high sensitivity and specificity of the new proposed method and the fact that primers were designed based on current BCoV sequences give basis to a more accurate diagnosis of BCoV-caused diseases, as well as to further insights on protocols for the detection of other Coronavirus representatives of both Animal and Public Health importance.O Coronavírus bovino (BCoV) pertence ao grupo 2 do gênero Coronavirus (Nidovirales: Coronaviridae) e é agente causador de enterites tanto em bezerros como em bovinos adultos, bem como de doença respiratória em bezerros. O presente estudo teve por objetivo desenvolver uma semi-nested RT-PCR para a detecção do BCoV com base em seqüências representativas e recentes do gene do nucleocapsídeo, região conservada do genoma dos coronavírus. Três primers foram desenhados, a primeira amplificação com um fragmento esperado de 463pb e a segunda (semi-nested) com um fragmento esperado de 306pb. A sensibilidade analítica foi determinada pela diluição do BCoV cepa Kakegawa (título HA: 256) na base de 10 em água ultra-pura tratada com DEPC, em soro fetal bovino (SFB) e em uma suspensão fecal negativa para o BCoV, onde foram encontrados resultados positivos até a diluição de 10-2, 10-3 e 10-7, respectivamente. Este resultado sugere que a quantidade total de RNA na amostra influencia na precipitação dos pellets pelo método de extração utilizado. Quando se utiliza amostra fecal, a grande quantidade de RNA total funciona como carreadora do RNA do BCoV, demonstrando elevada sensibilidade analítica e ausência de possíveis substâncias inibidoras da PCR. O protocolo final da semi-nested RT-PCR foi aplicado a 25 amostras fecais de vacas adultas, previamente avaliadas por uma nested RT-PCR RdRp utilizada como teste de referência, resultando em 20 e 17 amostras positivas para o primeiro e segundo teste, respectivamente. Os resultados dos dois sistema de diagnóstico apresentaram concordância substancial (kappa: 0,694). A elevada sensibilidade e especificidade do novo método proposto e o fato de que os primers foram desenhados baseados em sequências atuais do BCoV, oferecem bases para o diagnóstico mais acurado de infecções causadas pelo BCoV, assim como para novas perspectivas em protocolos de detecção de outros Coronavírus de importância tanto em saninade animal quanto em saúde pública

Detecção do vírus da bronquite infecciosa das galinhas e do metapneumovírus aviário utilizando uma reação de transcrição reversa com reação em cadeia pela polimerase duplex

A duplex RT-PCR assay is reported for the simultaneous detection of avian infectious bronchitis virus (IBV) and avian metapneumovirus (aMPV), the causative agents of major diseases in poultry. The duplex RT-PCR assay optimized showed a detection limit of 10-3 (101 EID50/50m L for IBV and 100.5 EID50/50m L for aMPV, respectively when two viruses were mixed and 10-1 for each one separated (103 EID50/50m L for IBV and 102.5 EID50/50m L for aMPV, respectively. It was specific, sensitive and applicable for the rapid detection of these viruses in clinical samples.  Descreve-se um ensaio de duplex RT-PCR assay para a detecção simultânea do vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) e do metapneumovirus aviário (aMPV), agentes etiológicos de doenças de elevada importância em avicultura. A duplex RT-PCR otimizada mostrou um limiar de detecção de 10-3 (101 EID50/50m L para IBV e 100.5 EID50/50m L para aMPV, respectivamente, quando da combinação dos dois vírus e 10-1 para cada um dos vírus em separado(103 EID50/50m L para IBV e 102.5 EID50/50m L para aMPV, respectivamente. O ensaio foi demonstrado como específico, sensível e aplicável à rápida detecção destes vírus em amostras clínicas.

O gene Cap de circovírus suíno tipo 2 (PCV2) evolui por seleção positiva in vitro

Este artigo relata a divergência genética de PCV2 após passagens em células das linhagens VERO e SK-RST. O teste exato de Fisher indicou tendência para seleção positiva no gene cap. Estes resultados permitem inferências relativas ao desenvolvimento de vacinas contra PCV2 e sobre a evolução do gênero Circovirus.This article reports the genetic divergence of PCV2 after passages in VERO and SK-RST cell lines. Fisher's exact test indicated a trend for positive selection on the cap gene. These results allow insights on the development of PCV2 vaccines and the evolution of the genus Circovirus

Experiments on intramuscular inoculation and feeding domestic cats (Felis catus) with brains of mice previously infected by rabies viruses

Nineteen kittens divided into four groups were fed with brains of mice infected with rabies viruses. Each four kittens (group I) received four brains infected with the PV fixed strain; nine kittens (group II) ingested 4-5 brains infected with the field isolate T-9/95, isolated from the Desmodus rotundus vampire bat; two kittens (group III) fed ten T-9/95-infected brains, and four cats consumed 32-37 PV strain-infected brains. One adult male, inoculated into masseter muscle with a 20% T-9/95-infected brain suspension, presented rabies after an incubation period of six days, followed with 8 days of clinical evolution, and died thereafter and this cat was considered as the rabies "positive standard". After observing for 20-230 days, all the cats feeding the rabid brains were submitted to euthanasia, by using Acepran®, Zoletil®, and T-61®. At necropsy, samples of brain, heart, lung, kidney, submaxillary salivary gland, and cervical medulla were collected from all the cats and further submitted to the direct fluorescence antibody test (dFA), mouse inoculation test (MIT) and to the reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. Brain, cervical medulla, and the submaxillary salivary gland of the positive standard cat were dFA-positive, and brain and cervical medulla were positive for MIT. All specimens of this cat tested by the RT-PCR were found positive. No animals ingesting PV or T-9/95 virus-infected brains developed clinical signs and all materials tested were negative by dFA and MIT. Several specimens, however, showed positive reactions by the RT-PCR technique, but cats were resistant to rabies through the viruses administered orally.Dezenove gatos, divididos em quatro grupos, foram alimentados com cérebros de camundongos infectados com vírus de raiva. Cada um dos quatro gatos (grupo I) receberam quatro cérebros infectados com vírus fixo PV; nove gatos (grupo II) ingeriram 4-5 cérebros infectados com uma amostra de campo T-9/95, isolada do morcego Desmodus rotundus; dois gatos (grupo III) ingeriram 10 cérebros infectados com T-9/95 e quatro gatos (grupo IV) ingeriram 32-37 cérebros infectados com vírus PV. Um macho adulto, inoculado no músculo masséter, com uma suspensão cerebral a 20% da amostra T-9/95, desenvolveu raiva após período de incubação de seis dias, seguidos por oito dias de evolução clínica, morrendo em seguida. Este gato foi denominado de "padrão positivo". Após observação por um período de 20-230 dias, todos os gatos que receberam cérebros foram submetidos à eutanásia, utilizando Acepran®, Zoletil® e T-61®. À necropsia, foram colhidas amostras do cérebro, coração, pulmão, rim, glândula salivar submaxilar e medula cervical e submetidas à prova de imunofluorescência direta (IFD), inoculação em camundongos (IC), e reação em cadeia pela polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR). No "padrão positivo", cérebro, medula cervical e glândula salivar foram positivos à IFD e à IC, cérebro e medula cervical foram os positivos. Todos os espécimes do "padrão positivo" foram positivos à RT-PCR. Nenhum animal que ingeriu cérebros contendo amostras de vírus PV ou T-9/95 apresentou sinais clínicos e todos os espécimes testados foram negativos à IFD e IC, no entanto, alguns espécimes reagiram positivamente à RT-PCR, porém, os gatos foram resistentes à raiva com vírus administrados oralmente