Study on erythropoietin subconjunctival administration in a glaucoma animal model

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na Especialidade de ClinicaGlaucoma is the number one cause of irreversible vision loss worldwide. Death of retinal ganglion cells (RGC), which results in the progressive loss of visual function, occurs in glaucoma and other ocular diseases caused by hypoxia and ischemia. Although glaucoma is a multifactorial neurodegenerative disease, the only currently method of treatment involves reduction of intraocular pressure and, at the present, there is no effective treatment to prevent RGC apoptosis. Notably, it has been reported that erythropoietin (EPO), a cytokine hormone produced in response to hypoxia, has significant neuroprotective and neuroregenerative properties in several types of ocular disorders. Pre-clinical studies in glaucoma animal models involving EPO have yielded very promising results. All studies involving EPO ocular administrations have used systemic, intravitreal or retrobulbar administration to reach retinal desired EPO concentrations. However, EPO chronic systemic administration can lead to adverse side effects related with haematopoiesis stimulation, while intravitreal or retrobulbar administrations are invasive procedures that can induce several complications such as endophthalmitis, retinal detachment, vitreitis, retinitis, choroiditis or cataracts. This thesis aims to clarify if EPO’s neuroprotection could be achieved by a non-invasive and safe periocular administration route without adverse effects. Being so, this work evaluates the subconjunctival route as an alternative for EPO administration in glaucoma disease. After the first in vitro study, where the permeation of EPO across the periocular tissues was quantified, all work was developed in in vivo models. EPO’s ocular permeation after subconjunctival administration was tested, both in physiological and glaucomatous conditions. Furthermore, both retinal morphological and physiological effects of EPO administered by this route were assessed in glaucomatous animals. Results showed that EPO, when administered subconjunctivally, can permeate the main ocular barriers and reach RGC layers, in both physiological and glaucomatous conditions, without significant local or systemic side effects. More than showing that EPO can reach the retina by this route, results also concluded that subconjunctival EPO administration seems to have structural and functional beneficial effects on the retina after glaucoma induction in rats.RESUMO - Estudo da administração subconjuntival de eritropoietina num modelo animal de glaucoma. - O glaucoma é a principal causa de cegueira irreversível no mundo. A morte das células ganglionares da retina (RGC) causada por hipóxia e isquémia resulta numa progressiva perda de visão. Apesar do glaucoma ser uma doença neurodegenerativa multifatorial, as únicas opções terapêuticas visam o controle da pressão intraocular, não havendo atualmente um tratamento eficaz para prevenir a apoptose das RGC. Estudos recentes demonstraram que a eritropoietina (EPO), uma glicoproteína sintetizada maioritariamente em resposta a estados de hipóxia, tem ação neuroprotetora e neuroregenerativa em várias doenças oculares, tendo revelado resultados promissores em vários modelos animais de glaucoma. Nos estudos experimentais em que a EPO foi utilizada como substância neuroprotetora, foi administrada pelas vias sistémica, intravítrea ou retrobulbar para se obterem concentrações terapêuticas na retina. No entanto, a administração sistémica prolongada de EPO pode produzir efeitos secundários adversos relacionados com o aumento da hematopoiese, enquanto que as administrações intravítrea ou retrobulbar são procedimentos invasivos suscetíveis de causar várias complicações tais como endoftalmite, descolamento de retina, vitreite, retinite, coroidite ou catarata. Esta tese teve por objetivo estudar uma via de administração periocular de EPO não invasiva, segura, eficaz e sem efeitos adversos. Assim, este trabalho avaliou a via subconjuntival como uma alternativa para a administração ocular de EPO em condições de glaucoma. No primeiro estudo in vitro, quantificou-se a permeação da EPO nos tecidos perioculares. O restante trabalho, desenvolvido em modelos in vivo, testou a permeação ocular da EPO após administração subconjuntival, tanto em condições fisiológicas como de glaucoma. O estudo contemplou ainda os efeitos morfológicos e fisiológicos da EPO ao nível da retina em animais glaucomatosos. Os resultados obtidos demostraram que a EPO, quando administrada pela via subconjuntival, pode permear as principais barreiras oculares e atingir as RGC, em ambas as condições testadas, fisiológicas e de glaucoma, sem efeitos adversos locais ou sistémicos apreciáveis. Além disso, revelaram que a administração subconjuntival de EPO parece ter efeitos benéficos estruturais e funcionais na retina após a indução de glaucoma experimental em ratos.N/

Estudo da penetração ocular da Eritropoietina administrada pela via subconjunctival em coelhos

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaEstudos recentes demonstram que a Eritropoietina (EPO), para além do seu conhecido efeito eritropoiético, tem acção neuroprotectora e neuroregenerativa sobre as células ganglionares da retina (RGC), sendo actualmente considerada um promissor agente terapêutico nas doenças isquémicas retinianas como o glaucoma. Estudos prévios utilizaram a via de administração sistémica, a via intravítrea ou a via retrobulbar para atingirem concentrações terapêuticas ao nível da retina, pouco exequíveis na prática clínica. Pretende-se estudar outra via de administração de EPO a nível ocular que demonstre eficácia, seja minimamente invasiva e que apresente uma baixa taxa de complicações. Este trabalho tem por objectivo avaliar a via subconjuntival como via eficaz para a administração ocular de EPO. Foram utilizados 6 coelhos albinos Nova Zelândia. A cada animal foi administrado num dos olhos 100 UI de EPO pela via subconjunctival. Os olhos contra laterais serviram como controlo. Foi doseada EPO no humor vítreo às 6, 12, 36 e 48 horas e no soro às 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 e às 48 horas após administração. A cada animal incluído no estudo foi realizada um hemograma no dia 0, no dia 7 e no dia 14 do ensaio, para avaliar os efeitos sistémicos da administração subconjunctival de EPO na eritropoiese, e foi realizado um electroretinograma (ERG) no dia 0 e no dia 30 do ensaio experimental. A administração da EPO pela via subconjunctival permitiu a obtenção de uma curva de concentração vítrea, que atingiu a concentração máxima 12 horas após injecção com um valor de 0,60 ± 0,06 mUI/ml. Observou-se também uma curva de absorção sistémica que atingiu a concentração máxima 3 horas após injecção com um valor de 33,4±0,66 mUI/ml. Tanto na contagem de glóbulos vermelhos como no hematócrito não se verificaram alterações significativas, nem aos 7 dias nem aos 14 dias após injecção. No que se refere ao ERG e analisando os resultados referentes à onda-a e ao intervalo N1-P1 verificou-se que não ocorreram alterações significativas desde o início do ensaio (dia 0) até ao final (dia 30). Quanto aos resultados observados na onda-b, observou-se um aumento de 49% (p=0,031) na resposta dos olhos tratados com EPO ao fim de 30 dias quando comparada com a resposta basal (dia 0). Concluiu-se com este estudo que a administração subconjuntival é uma via alternativa para a utilização terapêutica da EPO no tratamento de doenças isquémicas retinianas. Mais estudos são necessários para definir a cinética vítrea e plasmática da EPO administrada pela via subconjunctival, tanto em condições fisiológicas como em condições de doença isquémica ocular.ABSTRACT - Recently Erythropoietin (EPO) had been shown to have neuroprotective and neuroregenerative effects on retinal ganglion cells (RGC), apart from its erythropoietic properties. For this reason EPO is actually considered a promissory therapeutic agent on ischemic retinal diseases. The death of RGCs, which results in the progressive loss of visual function, occurs in glaucoma and other ocular diseases caused by hypoxia and ischemia. All the previous studies used the systemic, intraviteal or retrobulbar administration to acquire therapeutic concentrations on the retina, both difficult to use in clinical practice. The goal is to study another route of administration of EPO to the eye that shows efficiency and is minimally invasive while presenting a low tax of complications in clinical practice. With the present study we pretend to evaluate the efficacy of the subconjunctival delivery method of ocular EPO. New Zealand white rabbits were used (n=6). EPO (100 UI) was administered by subconjunctival route to the right eye of each animal. The opposite eye served as control. After administration, EPO was measured in the vitreous humor at 6, 12, 36 and 48 hours, and in plasma at 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 and 48 hours. A blood count was performed to each animal included in the study on day 0, day 7 and day 14 of the experiments, to assess the effects on erythropoiesis of subconjunctival administration of EPO and an electroretinogram (ERG) was performed on day 0 and on day 30 of the procedures to evaluate the effects of subconjunctival administration of EPO on the retina. The subconjunctival administration of EPO allowed a vitreous absorption curve which reached a maximum concentration 12 hours after injection with a value of 0.6 ± 0.06 mIU / ml and a plasmatic absorption curve which reached a maximum concentration after 3 hours injection with a value of 33.4 ± 0.66 mIU / ml. Both the red blood cell count and hematocrit evaluated on day 7 and day 14 after the injection showed no significant changes. Regarding the ERG and on what concerns the results of the a-wave and N1-P1 amplitudes, no significant changes were observed between the beginning of the experiments (day 0) and the end (30 days). Concerning to the b-wave amplitudes there was a remarkable increase of 49% (p=0,031) on the EPO treated eyes on day 30 when compared with the baseline response (day 0). In conclusion, subconjunctival administration of EPO is a possible alternative to the therapeutic use on ischemic retinal diseases. Further studies are necessary to assess the blood and intravitreal kinetic of EPO after subconjunctival administration, both in physiological conditions and ischemic ocular disease

Inactivation of SARS-CoV-2 by a chitosan/α-Ag2WO4 composite generated by femtosecond laser irradiation

In the current COVID‑19 pandemic, the next generation of innovative materials with enhanced anti‑ SARS‑CoV‑2 activity is urgently needed to prevent the spread of this virus within the community. Herein, we report the synthesis of chitosan/α‑Ag 2WO4 composites synthetized by femtosecond laser irradiation. The antimicrobial activity against Escherichia coli, Methicilin‑susceptible Staphylococcus aureus (MSSA), and Candida albicans was determined by estimating the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal/fungicidal concentration (MBC/MFC). To assess the biocompatibility of chitosan/α‑Ag 2WO4 composites in a range involving MIC and MBC/MFC on keratinocytes cells (NOK‑si), an alamarBlue™ assay and an MTT assay were carried out. The SARS‑ CoV‑2 virucidal effects was analyzed in Vero E6 cells through viral titer quantified in cell culture supernatant by PFU/mL assay. Our results showed a very similar antimicrobial activity of chitosan/α‑ Ag 2WO4 3.3 and 6.6, with the last one demonstrating a slightly better action against MSSA. The chitosan/α‑Ag 2WO4 9.9 showed a wide range of antimicrobial activity (0.49–31.25 μg/mL). The cytotoxicity outcomes by alamarBlue™ revealed that the concentrations of interest (MIC and MBC/ MFC) were considered non‑cytotoxic to all composites after 72 h of exposure. The Chitosan/α‑Ag 2WO4 (CS6.6/α‑Ag 2WO4 ) composite reduced the SARS‑CoV‑2 viral titer quantification up to 80% of the controls. Then, our results suggest that these composites are highly efficient materials to kill bacteria (Escherichia coli, Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus, and the yeast strain Candida albicans), in addition to inactivating SARS‑CoV‑2 by contact, through ROS production

Núcleos de Ensino da Unesp: artigos 2007

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq