Muscle degeneration and regeneration in dysferlin-deficient murine models

A distrofia muscular de cintura 2B (LGMD2B) é uma doença neuromuscular causada pela redução ou ausência da proteína sarcolemal disferlina. A disferlina está envolvida no reparo de membrana por atuar no tráfego e fusão de vesículas após estresse mecânico e, quando deficiente, as alterações nesta via levam à degeneração progressiva e irreversível das fibras musculares. A disferlina também tem sido implicada na inflamação e na miogênese durante a degeneração e regeneração muscular. Recentemente, identificou-se um tricomplexo formado pela disferlina com duas proteínas citoplasmáticas, FAM65B e HDAC6, no início da diferenciação de mioblastos. Investigar a regulação destas interações é importante para avançar na compreensão das funções da disferlina e seu papel na função muscular. Neste estudo, a miogênese e o reparo muscular foram investigados in vivo e in vitro em modelos com deficiência de disferlina. Para estudar o processo regenerativo in vivo, utilizamos um modelo de eletroporação para induzir degeneração/regeneração no músculo distrófico levemente afetado do camundongo disferlina-deficiente SJL/J. A avaliação histopatológica e a expressão relativa dos genes Pax7, Myf5, MyoD e miogenina foram acompanhadas durante a recuperação muscular em diferentes tempos após a lesão. Além disso, investigamos os efeitos da deficiência de disferlina na expressão dos genes Fam65b e Hdac6. Observamos um curso de tempo alterado do processo de degeneração e regeneração, com notável capacidade regenerativa nos camundongos disferlina-deficientes, caracterizada por uma resposta mais rápida e eficaz nos primeiros dias após a lesão, em comparação com os camundongos normais. Além disso, Fam65b e Hdac6 foram ativados nos estágios iniciais da regeneração muscular, também com expressão mais elevada de ambos os genes no camundongo SJL/J. Esses resultados podem estar relacionados à uma possível condição pré-ativada do processo regenerativo no músculo de camundongos distróficos jovens. Para os experimentos in vitro, utilizamos células musculares humanas de pacientes com LGMD2B, com deficiência total de disferlina. A diferenciação muscular induziu a formação de miotubos mais finos e com menor frequência de núcleos por miotubo, sugerindo uma progressão retardada da formação de miotubos em células com LGMD2B. A expressão de mRNA de MYOD e FAM65B não foi aparentemente afetada pela deficiência de disferlina durante a diferenciação, enquanto HDAC6 apresentou um pico transitório após 24 horas, apenas nas células normais. Além disso, o pico da miogenina ocorreu mais cedo nas células normais. Portanto, sugerimos que a disferlina estaria menos envolvida nos eventos iniciais de formação de pequenos miotubos, mas poderia desempenhar um papel importante nos estágios posteriores de diferenciação, que envolvem crescimento e alongamento de miotubos. Estes resultados fornecem dados interessantes para investigações adicionais de como a deficiência de disferlina afeta os reguladores miogênicos durante a diferenciação. Em conjunto, nossos dados sugerem que a deficiência de disferlina provoca alterações temporais na progressão dos eventos de regeneração muscular e de miogênese. A identificação de uma possível regulação dos componentes do tricomplexo pela disferlina pode indicar novas direções para investigar esta via como um potencial alvo para terapiasLimb girdle muscular dystrophy 2B (LGMD2B) is a neuromuscular disease caused by reduction or absence of the sarcolemmal protein dysferlin. Dysferlin is involved in membrane repair by acting on vesicular traffic and fusion after mechanical stress and, when deficient, changes in this pathway lead to progressive and irreversible degeneration of muscle fibers. Dysferlin has also been implicated in inflammation and myogenesis during muscle degeneration and regeneration. Recently, a tricomplex formed by dysferlin with two cytoplasmic proteins, FAM65B and HDAC6, was identified at the earlier stages of myoblast differentiation. Investigating the regulation of these interactions is important to advance in the understanding of the functions of dysferlin and its role in muscle function. In this study, myogenesis and muscle repair were investigated in vivo and in vitro in models with dysferlin deficiency. To study this effect in the regenerative process of muscle in vivo, we used a model of electroporation inducing muscle degeneration/regeneration in the mildly affected dystrophic muscle of dysferlin-deficient SJL/J mouse. The histopathological evaluation and the relative expression of the genes Pax7, Myf5, MyoD and myogenin were accompanied during muscle recovery at different time points after injury. In addition, we investigated the effects of dysferlin deficiency in the expression of genes Fam65b and Hdac6. We observed an altered time course of the degeneration and regeneration process, with remarkable regenerative capacity in dysferlin-deficient mice, characterized by a faster and effective response in the first days after injury, as compared to normal mice. Moreover, Fam65b and Hdac6 were activated at the early stages of muscle regeneration, also with higher expression of both genes in the SJL/J mouse. These results may have been due to a possible pre-activated condition of the regenerative process in the muscle of young dystrophic mice. For the in vitro experiments, we used human muscle cells from patients with LGMD2B, with total deficiency of dysferlin. The muscular differentiation induced the formation of thinner myotubes and reduced frequency of myonuclei per myotube, suggesting a delayed progression of myotube formation in LGMD2B cells. mRNA expression of MYOD and FAM65B was not apparently affected by dysferlin deficiency during differentiation, while HDAC6 exhibited a transient peak, only in healthy cells, after 24 hours. In addition, the myogenin peak occurred earlier in healthy cells. Thus, we suggested that dysferlin would be less involved in the first events of formation of early small myotubes, but could play an important role in the later stages of differentiation, which involves myotube growth and elongation. These results provide interesting data for further investigation of how dysferlin deficiency affects myogenic regulators during differentiation. Taken together, our data suggest that dysferlin deficiency causes temporal changes in the progression of the muscle regeneration and myogenesis events. The identification of possible regulation of tricomplex components by dysferlin may indicate new directions for investigating this pathway as a potential target for therapie

Uma Nova Abordagem do Ciclo Reprodutivo dos Machos e Fêmeas, e da Origem e Desenvolvimento dos Oócitos dos Ostariophysi e Perciformes Neotropicais Aplicada a Representantes da Série Otophysi, Gymnotus sp. (Gymnotidae), Hoplias Malabaricus (Erythrinidae), Sorubim Lima (Pimelodidae) e Tanichthys Albonubes (Cyprinidae), e dos Perciformes, Cichla Temensis (Cichlidae)

Nos peixes, durante a vida reprodutiva o desenvolvimento gonadal é cíclico e anual. As alterações estruturais das gônadas de machos e fêmeas provêm parâmetros úteis para a sua classificação macroscópica e microscópica. Porém, o desenvolvimento das células germinativas, nem sempre é consoante com os diferentes tipos de classificação e, machos e fêmeas nem sempre parecem concatenados. Neste estudo, aplicando-se propostas recentes, utilizadas primariamente para peixes derivados, notadamente os Perciformes marinhos, e tomando como modelo experimental representantes da série Otophysi, Hoplias malabaricus (Characiformes), Tanichthys albonubes (Cypriniformes), Sorubim lima (Siluriformes) e Gymnotus sp. (Gymnotiformes), e dos Perciformes Neotropicais, Cichla temensis, foram descritos, comparativamente, os eventos iniciais da oogênese e da espermatogênese, assim como o desenvolvimento oocitário a fim de traçar um paralelo entre grupos basais e derivados. A partir dos resultados, verificou-se que a maioria dos eventos morfológicos durante o desenvolvimento oocitário é similar entre grupos basais e derivados. Os Perciformes de água doce divergem dos grupos basais por duas características: a presença de inclusões lipídicas, que surgem no citoplasma perinuclear após o início da formação dos alvéolos corticais e deposição de vitelo e por uma tênue proteólise do vitelo durante a maturação final. A foliculogênese e espermatogênese não apresentam divergências e parecem ser processos conservados entre os Teleostei. Durante a fase de Regeneração, os eventos iniciais desses processos em fêmeas e machos, respectivamente, são responsáveis por altos índices de proliferação das células germinativas, quando comparado às demais fases. Além disso, analisou-se ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo

Gametogênese em peixes: aspectos relevantes para o manejo reprodutivo

In most of Teleostei fish gametogenesis is a cyclical and seasonal event. The renewal of the gametes, their development, differentiation, maturation and release provoke many alterations of gonadal features along the annual reproductive cycles. These alterations are used to recognize phases of the reproductive cycles. The recognition of these phases constitutes one of the parameters applied to the management of fisheries resources. Herein a recent proposal of the recognition of the reproductive phases in the Perciformes is exposed and its adaptation to the Neotropical Ostariophysi (Siluriformes and Characiformes) is provided. In addition, the gametogenesis in the Teleostei fish is briefly described.Na maioria dos peixes Teleostei, a gametogênese é um evento cíclico e sazonal. A renovação dos gametas, seu desenvolvimento, diferenciação, maturação e liberação provocam várias alterações nas características das gônadas ao longo dos ciclos reprodutivos anuais. Essas alterações são utilizadas para reconhecer fases nos ciclos reprodutivos. O reconhecimento dessas fases constitui um dos parâmetros aplicados na gestão dos recursos pesqueiros. Este trabalho apresenta uma recente proposta de reconhecimento das fases reprodutivas desenvolvida para os Perciformes adaptada para os Ostariophysi neotropicais (Siluriformes e Characiformes). Soma-se a isso uma breve descrição da gametogênese nos peixes Teleostei

The mdx Mutation in the 129/Sv Background Results in a Milder Phenotype: Transcriptome Comparative Analysis Searching for the Protective Factors.

The mdx mouse is a good genetic and molecular murine model for Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), a progressive and devastating muscle disease. However, this model is inappropriate for testing new therapies due to its mild phenotype. Here, we transferred the mdx mutation to the 129/Sv strain with the aim to create a more severe model for DMD. Unexpectedly, functional analysis of the first three generations of mdx129 showed a progressive amelioration of the phenotype, associated to less connective tissue replacement, and more regeneration than the original mdxC57BL. Transcriptome comparative analysis was performed to identify what is protecting this new model from the dystrophic characteristics. The mdxC57BL presents three times more differentially expressed genes (DEGs) than the mdx129 (371 and 137 DEGs respectively). However, both models present more overexpressed genes than underexpressed, indicating that the dystrophic and regenerative alterations are associated with the activation rather than repression of genes. As to functional categories, the DEGs of both mdx models showed a predominance of immune system genes. Excluding this category, the mdx129 model showed a decreased participation of the endo/exocytic pathway and homeostasis categories, and an increased participation of the extracellular matrix and enzymatic activity categories. Spp1 gene overexpression was the most significant DEG exclusively expressed in the mdx129 strain. This was confirmed through relative mRNA analysis and osteopontin protein quantification. The amount of the 66 kDa band of the protein, representing the post-translational product of the gene, was about 4,8 times higher on western blotting. Spp1 is a known DMD prognostic biomarker, and our data indicate that its upregulation can benefit phenotype. Modeling the expression of the DEGs involved in the mdx mutation with a benign course should be tested as a possible therapeutic target for the dystrophic process

List of DEGs exclusive of the mdx¹²⁹.

<p>List of DEGs exclusive of the mdx¹²⁹.</p

Venn diagram showing genes in common and exclusive DEGs in each of compared lists.

<p>Venn diagram showing genes in common and exclusive DEGs in each of compared lists.</p

Primers used in relative quantification of gene expression.

<p>Primers used in relative quantification of gene expression.</p

Graphical representation of comparative functional test in the mdx^C57Bl as compared to the three mdx¹²⁹ generations.

<p>Data of the fore limbs in the bar test and grip strength test are shown with the median expression and standard error range for each age/strain. The number of tested animals in each generation is also presented. * p<0,05.</p

Comparative histological analysis.

<p>HE staining of gastrocnemius and diaphragm muscles, in mdx^C57BL and mdx¹²⁹ mice in the age of 6 months.</p