Atividade anti-candida de frações bioativas de uncaria tomentosa (Willd) DC. e sinergismo com fluconazol e terbinafina

Infecções fúngicas resistentes mostram uma crescente prevalência nas últimas décadas, levando à procura fármacos mais eficazes, incluindo produtos naturais. Uncaria tomentosa (unha-de-gato) possui uma complexa composição de polifenois, alcaloides e triterpenos, que tem sido pouco explorada nesse contexto. Assim, o presente trabalho teve por objetivo a avaliação da atividade anti-Candida e de mecanismos de ação eventualmente envolvidos. Para essa finalidade seis isolados de Candida não-albicans foram selecionados pelo seu histórico de resistência. Amostras de cascas secas foram extraídas com EtOH a 50%, seguido de concentração e armazenagem a 10 °C durante 24 h. A porção solúvel foi separada e fracionada em fase polimérica sólida, originando três frações ricas em polifenois, alcaloides e triterpenos. A porção insolúvel em água (Water-insoluble Fraction - WIF) foi retomada no mesmo solvente etanólico, repetindo-se o processo anterior. Os testes exploratórios de susceptibilidade antifúngica revelaram atividade moderada para todas as frações solúveis e uma atividade superior para a fração insolúvel. A análise por CLAE e o teste da Vanilina ácida indicaram a predominância de polifenóis de alta massa molecular (70,8%) em WIF. A associação da fração WIF com terbinafina e fluconazol mostrou uma clara atividade sinérgica, com alterações morfológicas evidenciadas por MEV e pelo teste com sorbitol. Testes utilizando verapamil (inibidor da bomba de efluxo) excluíram a participação deste mecanismo. Pelo contrário, os resultados das análises por DSC e FT-IR apontam para um mecanismo externo à célula. O conjunto das observações sugere um mecanismo de ação sobre a parede celular, provavelmente vinculado a interações intermoleculares entre a fração e os antifúngicos testados.Resistant fungal infections show an increasing prevalence in recent decades, demanding therefore more effective new drugs, including herbal products. Uncaria tomentosa (cat's claw) has a complex polyphenols, alkaloids and triterpene composition, which has been little explored in that sense. Thus, the present study aimed at evaluation of the anti-Candida activity and related mechanisms of action. For this purpose six isolates of non-albicans Candida species were selected owing their history of antifungal resistance. Samples of the dried bark were extracted with 50% EtOH, followed by concentration and storage (10 °C for 24 h) steps. The soluble portion was separated and fractionated on a solid polymer phase, yielding three enriched fractions of polyphenols, alkaloids and triterpenes. The water-insoluble portion (WIF) was dissolved again using the same ethanolic solvent, and submitted to the procedure described above. Screening antifungal susceptibility testing revealed just a moderate activity for all soluble fractions, and a superior one respecting the WIF fraction. HPLC analysis and vanillin acid assay of WIF indicated the polyphenol prevalence (70.8 %). The association of fraction WIF with terbinafine and fluconazole showed a clear synergic activity with morphological changing, as observed by MEV and the wall integrity test with sorbitol. Tests using verapamil (inhibitor of efflux pump) excluded the participation of this mechanism in the synergic response. Moreover, the results from both FT-IR and DSC analysis of WIF, alone and combined with terbinafine and fluconazole, suggest a mechanism acting outside the cell membrane. The results all together hint a mechanism of action probably linked to wall cell, probably due to specific intermolecular interactions between the fraction WIF and both antifungals matter of this study

In Vitro additive effect on griseofulvin and terbinafine combinations against multidrug-resistant dermatophytes

Griseofulvin (GF) and terbinafine (TF) are commonly used drugs to treat dermatophytosis, a fungal infection of the skin. Today there is an increase in drug resistance to these antifungals which highlight the need for alternative synergistic therapies. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of GF and TF were determined against fungi clinical isolates from local hospitals with values ranging 0.03−2.0 µg mL-1 and 0.24−4.0 µg mL-1, respectively. A checkboard test was used to determine the combination of GF:TF which could induce an additive effect against the fungi isolates Multidrug-resistant isolates showed susceptibility after treatment with 16:2 µg mL-1 GF:TF. An MTT assay further verified that GF and TF combinations have greater additive effect against pathological and multidrug-resistant isolates than antifungals alone. Herein we disclose GF:TF combinations that could constitute as a possible new anti-dermatophyte therapy

Investigação in vitro da atividade antifúngica de uncaria tomentosa (willd) d. c. frente a leveduras patogênicas

Relevância Etnofarmacológica: Uncaria tomentosa (unha-de-gato) é uma videira de ampla distribuição nas florestas tropicas das Américas, recentemente incluída na Farmacopéia Americana e consta entre as espécies vegetais mais intensamente estudadas nos últimos anos. A espécie tem sido usada tradicionalmente no tratamento de doenças reumáticas, câncer, assim como para alergias e infecções microbianas. As três frações bioativas reconhecidas incluem: alcalóides oxindólicos (FALC), polifenóis (FPOLIF) e derivados triterpênicos do ácido quinóvico (FAQ). Objetivo: O presente estudo tem como objetivo a investigação da atividade antifúngica de extrato bruto e de frações de U. tomentosa frente a leveduras patogênicas. Materiais e Métodos: Foram utilizados o extrato bruto de cascas, frações purificadas de FAQ e FALC, obtidas por técnicas de fracionamento em fase sólida, e a fração FPOLIF, obtida por precipitação. Os teores de triterpenos e de alcalóides oxindólicos pentacíclicos foram determinados por CLAE-DAD, e o de polifenóis totais por Folin Ciocalteau. O ensaio antifúngico de triagem, a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e a avaliação de sinergismo entre as frações purificadas e o fluconazol foram realizados segundo as recomendações do documento M27-A3 da CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) de 2008. Resultados: No teste de triagem, tanto o extrato bruto quanto as frações causaram inibição de Candida albicans, C. glabrata, C. krusei e C. parapsilosis. Os valores de CIM indicam uma atividade significativa da fração FPOLIF, na faixa de inibição de 7,81 a 15,62 μg/mL frente a C. glabrata e C. parapsilosis. A fração FAQ também se mostrou ativa, porém, em menor escala. Ambas as frações também demonstraram efeito sinérgico com fluconazol, obtendo um resultado de inibição de 0,98 μg/mL frente a C. krusei, uma cepa intrinsicamente resistente a esse antifúngico azólico. Conclusões: A atividade frente a leveduras patogênicas e o forte indício de atividade sinérgica com fluconazol são inéditos para a espécie e abrem uma nova perspectiva de pesquisa sobre as frações de triterpenos e polifenóis de unha-de-gato.Ethnopharmacological Relevance: Uncaria tomentosa (cat's claw) is a vine widely distributed in tropical forests of South America, recently included in the United States Pharmacopoeia. Moreover, cat’s claw is one of most intensively studied medicinal herbal in recent years. The species has been traditionally used in the treatment of rheumatic diseases, cancer, as well as microbial infections and allergies. The three bioactive fractions recognized include: oxindole alkaloids (FALC), polyphenols (FPOLIF) and triterpenic acid derivatives quinovic (FAQ). Objective: This study aims to investigate the antifungal activity of crude extract and fractions of U. tomentosa against pathogenic yeasts. Materials and Methods: A crude extract from its bark as well the purified fractions FALC and FAQ, previously obtained by fractioning solid-phase techniques, and FPOLIF fraction, obtained by precipitation, were prepared for that intend specifically. The contents of triterpenes and pentacyclic oxindole alkaloids were determined by HPLC-DAD. The total polyphenols content was estimated through Folin Ciocalteau assay. For testing antifungal screening, the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and the assessment of synergism between fluconazole and purified fractions were performed according to the recommendations of the document M27-A3 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), 2008. Results: In the screening test, both the crude extract and purified fractions were able to inhibit Candida albicans, C. glabrata, C. krusei and C. parapsilosis growth. Regarding the FPOLIF fraction, MIC values ranging form 7.81 to 15.62 μg/mL against C. glabrata and C. parapsilosis suggested a profitable antifungal activity for that fraction. FAQ fraction was also active but to a lesser extent. Nonetheless, both fractions showed a perceptible synergistic effect with fluconazole, as noticed by growth inhibition with a 0.98 μg/mL concentration against C. krusei, the last one a recognized azole-resistant strain. Conclusions: Both the antifungal activity against pathogenic yeasts and the strong evidence of synergistic activity with fluconazole are first-time reported to Cat’s Claw bioactive derivative as far as we known. This found discloses new research perspectives on the antifungal activity of polyphenols and triterpene fractions of Cat's Claw. Further studies to enlighten the activity extent and antifungal mechanism are in progress

Investigação in vitro da atividade antifúngica de uncaria tomentosa (willd) d. c. frente a leveduras patogênicas

Relevância Etnofarmacológica: Uncaria tomentosa (unha-de-gato) é uma videira de ampla distribuição nas florestas tropicas das Américas, recentemente incluída na Farmacopéia Americana e consta entre as espécies vegetais mais intensamente estudadas nos últimos anos. A espécie tem sido usada tradicionalmente no tratamento de doenças reumáticas, câncer, assim como para alergias e infecções microbianas. As três frações bioativas reconhecidas incluem: alcalóides oxindólicos (FALC), polifenóis (FPOLIF) e derivados triterpênicos do ácido quinóvico (FAQ). Objetivo: O presente estudo tem como objetivo a investigação da atividade antifúngica de extrato bruto e de frações de U. tomentosa frente a leveduras patogênicas. Materiais e Métodos: Foram utilizados o extrato bruto de cascas, frações purificadas de FAQ e FALC, obtidas por técnicas de fracionamento em fase sólida, e a fração FPOLIF, obtida por precipitação. Os teores de triterpenos e de alcalóides oxindólicos pentacíclicos foram determinados por CLAE-DAD, e o de polifenóis totais por Folin Ciocalteau. O ensaio antifúngico de triagem, a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e a avaliação de sinergismo entre as frações purificadas e o fluconazol foram realizados segundo as recomendações do documento M27-A3 da CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) de 2008. Resultados: No teste de triagem, tanto o extrato bruto quanto as frações causaram inibição de Candida albicans, C. glabrata, C. krusei e C. parapsilosis. Os valores de CIM indicam uma atividade significativa da fração FPOLIF, na faixa de inibição de 7,81 a 15,62 μg/mL frente a C. glabrata e C. parapsilosis. A fração FAQ também se mostrou ativa, porém, em menor escala. Ambas as frações também demonstraram efeito sinérgico com fluconazol, obtendo um resultado de inibição de 0,98 μg/mL frente a C. krusei, uma cepa intrinsicamente resistente a esse antifúngico azólico. Conclusões: A atividade frente a leveduras patogênicas e o forte indício de atividade sinérgica com fluconazol são inéditos para a espécie e abrem uma nova perspectiva de pesquisa sobre as frações de triterpenos e polifenóis de unha-de-gato.Ethnopharmacological Relevance: Uncaria tomentosa (cat's claw) is a vine widely distributed in tropical forests of South America, recently included in the United States Pharmacopoeia. Moreover, cat’s claw is one of most intensively studied medicinal herbal in recent years. The species has been traditionally used in the treatment of rheumatic diseases, cancer, as well as microbial infections and allergies. The three bioactive fractions recognized include: oxindole alkaloids (FALC), polyphenols (FPOLIF) and triterpenic acid derivatives quinovic (FAQ). Objective: This study aims to investigate the antifungal activity of crude extract and fractions of U. tomentosa against pathogenic yeasts. Materials and Methods: A crude extract from its bark as well the purified fractions FALC and FAQ, previously obtained by fractioning solid-phase techniques, and FPOLIF fraction, obtained by precipitation, were prepared for that intend specifically. The contents of triterpenes and pentacyclic oxindole alkaloids were determined by HPLC-DAD. The total polyphenols content was estimated through Folin Ciocalteau assay. For testing antifungal screening, the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and the assessment of synergism between fluconazole and purified fractions were performed according to the recommendations of the document M27-A3 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), 2008. Results: In the screening test, both the crude extract and purified fractions were able to inhibit Candida albicans, C. glabrata, C. krusei and C. parapsilosis growth. Regarding the FPOLIF fraction, MIC values ranging form 7.81 to 15.62 μg/mL against C. glabrata and C. parapsilosis suggested a profitable antifungal activity for that fraction. FAQ fraction was also active but to a lesser extent. Nonetheless, both fractions showed a perceptible synergistic effect with fluconazole, as noticed by growth inhibition with a 0.98 μg/mL concentration against C. krusei, the last one a recognized azole-resistant strain. Conclusions: Both the antifungal activity against pathogenic yeasts and the strong evidence of synergistic activity with fluconazole are first-time reported to Cat’s Claw bioactive derivative as far as we known. This found discloses new research perspectives on the antifungal activity of polyphenols and triterpene fractions of Cat's Claw. Further studies to enlighten the activity extent and antifungal mechanism are in progress